非定向激活沉默基因簇挖掘鏈霉菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展

宋國(guó)棟,廖宏娟,張志斌,朱 篤,2*

1江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330022;2江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西省生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330013

微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物是一類結(jié)構(gòu)多樣、功能復(fù)雜且具備特殊生物活性的物質(zhì),在藥物研究與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域占據(jù)著重要的地位。截至目前,從微生物中鑒定出大約30萬(wàn)種化合物,有超過(guò)60 %的抗生素來(lái)源于鏈霉菌。然而,隨著大量次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離,從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)具有顯著生物活性且結(jié)構(gòu)新穎抗生素的概率越來(lái)越低[1-3]。近些年,隨著基因組測(cè)序技術(shù)在微生物測(cè)序方面的廣泛應(yīng)用,大量的鏈霉菌基因組信息被公開(kāi)[4]。通過(guò)對(duì)鏈霉菌基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其中仍有一大部分的基因處于沉默狀態(tài),這表明還有大量潛在的次級(jí)代謝產(chǎn)物尚未被發(fā)現(xiàn)[5]。受限于常規(guī)培養(yǎng)條件,鏈霉菌生物合成基因簇未能有效激活,因而其獨(dú)特的代謝產(chǎn)物途徑往往表達(dá)較少或不表達(dá)。因此,通過(guò)激活鏈霉菌沉默基因簇以挖掘新型活性次級(jí)代謝產(chǎn)物具有重要意義。

為了激活鏈霉菌沉默基因表達(dá),以發(fā)現(xiàn)更多活性次級(jí)代謝產(chǎn)物,迄今已有多種激活沉默基因簇的方法得到開(kāi)發(fā)和應(yīng)用[6,7]。常用的策略可分為兩大類:一類是非定向激活策略,即通過(guò)改變培養(yǎng)基的組成(碳源、氮源、微量元素、化學(xué)激發(fā)子)[8,9]、菌株的生長(zhǎng)環(huán)境(溫度、pH、曝氣、容器類型)[6]或微生物共培養(yǎng)[10]等方式,誘導(dǎo)鏈霉菌產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物;另一類是定向激活策略,即通過(guò)基因編輯技術(shù)(CRISPR-Cas9)[11]、靶向激活特定基因簇(啟動(dòng)子工程、途徑特異性調(diào)控因子激活、異源表達(dá))等手段[12,13],使鏈霉菌沉默基因得以表達(dá)。相較于定向激活策略,非定向激活策略不需要建立目標(biāo)菌株的遺傳操作體系,因此具有操作簡(jiǎn)單、可同時(shí)激活多個(gè)生物合成基因簇(而不是某一特定的生物合成基因簇)等優(yōu)點(diǎn),其應(yīng)用更為廣泛。本文簡(jiǎn)要綜述了改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件激活策略、共培養(yǎng)策略、添加化學(xué)激發(fā)子及全局性調(diào)控等非定向激活鏈霉菌沉默基因的策略(見(jiàn)圖1),并描述了這一領(lǐng)域所面臨的問(wèn)題和未來(lái)的發(fā)展前景。

圖1 非定向策略激活沉默基因Fig.1 No-target strategies for activating silent genes clusters

1 改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件的激活策略

1.1 改變培養(yǎng)基的組成

培養(yǎng)基組成(即碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等)對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響非常復(fù)雜,且對(duì)不同微生物產(chǎn)生相當(dāng)明顯的差異[14]。大量的研究表明,營(yíng)養(yǎng)組成的變化可激發(fā)鏈霉菌產(chǎn)生各種新型化合物[15](見(jiàn)圖2、表1)。

表1 改變培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件發(fā)現(xiàn)新的活性代謝產(chǎn)物Table 1 Change of medium composition,culture conditions to discover new active metabolites

圖2 化合物1～37結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of compounds 1-37

1.1.1 碳氮源

Martin等[16]描述了碳氮源種類及碳氮比對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響。葡萄糖是一種優(yōu)質(zhì)的生長(zhǎng)碳源,但是濃度過(guò)高時(shí)會(huì)干擾次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成,這已經(jīng)被Romero-Rodriguez等[17]所驗(yàn)證。Gullon等[18]觀察到當(dāng)葡萄糖作為碳源,可以通過(guò)抑制S.lividans中afsMRNA(編碼一個(gè)參與刺激次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的全局性調(diào)控基因)的表達(dá),從而抑制放線菌紫紅素(actinorhodin)的產(chǎn)生;當(dāng)葡萄糖用甘油替代時(shí),則沒(méi)有觀察到這種抑制作用。同樣地,Rateb等[19]將ISP2培養(yǎng)基中的葡萄糖換成甘油用于培養(yǎng)Streptomycessp.C34,并從該菌分離到4個(gè)新的聚酮類化合物chaxamycins A～D(1～4)。Sujatha等[20]比較了葡萄糖、乳糖、果糖、甘油等14種碳源對(duì)海洋鏈霉菌Streptomycessp.BT-408生產(chǎn)聚酮類抗生素產(chǎn)量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌以葡萄糖為碳源時(shí)產(chǎn)量最高,其次是果糖。

氮是蛋白質(zhì)和核酸的重要組成之一,不同的氮源會(huì)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成有一定的影響[21]。鏈霉菌中低濃度的氮源有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成已被廣泛證明[14]。Sujatha等[20]比較了6種無(wú)機(jī)氮源和13種氨基酸(作為唯一氮源)對(duì)Streptomycessp.BT-408生產(chǎn)聚酮類抗生素的影響,結(jié)果表明硝酸銨為氮源時(shí)抗生素產(chǎn)量最高。N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是細(xì)菌肽聚糖的一部分,它是一種優(yōu)質(zhì)的碳氮源。Rigali等[22]研究了GlcNAc對(duì)S.griseus(鏈霉素的生產(chǎn)者)形態(tài)分化與次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明,添加較多的GlcNAc,S.griseus的形態(tài)分化和抗生素的生產(chǎn)都被抑制,而添加較少的GlcNAc則得到相反的效果。同時(shí),Wezel等[23]發(fā)現(xiàn),較少的GlcNAc有利于S.cescoloniesA3中抗生素的生成,而較多的GlcNAc則呈現(xiàn)抑制作用。此后證明,這種現(xiàn)象在鏈霉菌中普遍存在,稱為氮抑制。這種機(jī)制不僅會(huì)影響初級(jí)氮代謝,還會(huì)影響到次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。

總之,碳氮源種類和濃度對(duì)鏈霉菌的生長(zhǎng)發(fā)育以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成都有重要影響,且這一過(guò)程要受到嚴(yán)格的基因調(diào)控。碳源選擇的這一過(guò)程被稱為碳分解代謝物阻遏效應(yīng)(carbon catabolite repression,CCR),與其它革蘭氏陽(yáng)性菌不同,鏈霉菌中的CCR不受磷酸烯醇丙酮-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphoenolpyruvate-phosphotransferase system,PTS)的控制,而是通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸葡萄糖[24],同時(shí)被葡萄糖激酶(glucokinase,Glk)磷酸化,目前已證明了Glk在CCR這一過(guò)程中的關(guān)鍵作用[25],被稱為Glk依賴機(jī)制,此外葡萄糖依賴機(jī)制也被認(rèn)為在CCR中發(fā)揮著重要作用[25]。與Glk相似,在氮代謝中,GlnR(一種全局性調(diào)控因子)在雙組分系統(tǒng)(two-component system,TCS)中發(fā)揮著重要的作用[26]。

1.1.2 微量元素

營(yíng)養(yǎng)元素尤其是微量元素對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成和積累有重要作用。微量元素可作為次級(jí)代謝產(chǎn)物的組成元素,也可對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶的活性有激活或抑制作用。

磷是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的中重要元素,參與遺傳物質(zhì)合成、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持膜完整性等多個(gè)至關(guān)重要的過(guò)程,并通過(guò)磷酸化發(fā)揮重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用[27]。近些年,磷酸鹽對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的分子機(jī)制已被闡明,即PhoR-PhoP(又稱Pho規(guī)則)雙分子系統(tǒng)[27]。已有無(wú)機(jī)磷酸鹽對(duì)鏈霉菌生理和抗生素產(chǎn)量影響的報(bào)道,高濃度磷酸鹽(≥10 mmol/L)培養(yǎng)基會(huì)導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量驟減或消失;相反,低磷酸鹽水平(< 0.1 nmol/L)可導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物的增加[28]。一些研究表明,PhoR-PhoP系統(tǒng)通過(guò)間接的方式影響其他轉(zhuǎn)錄因子(AtrA[29]、AveR[30])表達(dá),從而引起次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化。

微量金屬被證明既能刺激次級(jí)代謝產(chǎn)物的增加,又能激活微生物中沉默的生物合成基因簇[31]。金屬離子與微生物之間通常存在三種相互作用:在細(xì)胞中發(fā)生反應(yīng)、同化反應(yīng)和異化反應(yīng)。Akhter等[32]采用不同類型(NiCl2、CoCl2、ZnSO4、CrCl3、MnCl2)、不同濃度(100、200、400、800 μmol/L)金屬離子對(duì)從海洋沉積物中分離出的S.pratensisNA-ZhouS1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),確定Ni離子效果最佳,并成功分離出2個(gè)新的芳香族聚酮stremycin A、B(5、6)以及4個(gè)已知的化合物(7～10)。Shi等[33]同樣用含鎳培養(yǎng)基從Streptomycessp.WU20中分離到1個(gè)新型的環(huán)唑嗪類似物(11)。Liu等[34]將Streptomycessp.FXJ1.172放在添加了鐵離子的葡萄糖-酵母提取物-麥芽提取物(Glucose-yeast extract-malt extract,GYM)培養(yǎng)基中培養(yǎng),產(chǎn)生了1個(gè)新型的環(huán)肽類化合物cyclic depsipeptide NC-1(12)。

1.1.3 更換培養(yǎng)基

除了改變培養(yǎng)基中的碳源、氮源、添加微量元素等方式,更換培養(yǎng)基也可以獲得更豐富的代謝產(chǎn)物。Wu等[35]使用不同的培養(yǎng)基(ISP2、ISP4、ACM和TSB),對(duì)一株海洋來(lái)源的鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng),最終在ACM培養(yǎng)基中分離出1個(gè)新型聚酮類化合物inthomycin B(13)。Lu等[36-40]對(duì)Streptomycessp.CS進(jìn)行培養(yǎng),在YMG瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)生3個(gè)新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物(14～16),在ISP2培養(yǎng)基中產(chǎn)生5個(gè)新的巴弗洛霉素衍生物(17～21),在Waksman合成培養(yǎng)基中產(chǎn)生5個(gè)新的聚酮類化合物(22～26),在燕麥培養(yǎng)基中產(chǎn)生3個(gè)新的安莎霉素類化合物naphthomycins L、M、N(27～29)以及3個(gè)已知的naphthomycins(30～32)。Ding等[41]將一株海洋來(lái)源的鏈霉菌Streptomycessp.DT-A37放在Gause′s液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),分離得到2個(gè)主產(chǎn)物:全霉素(holomycin)(33)及其開(kāi)環(huán)衍生物(34)。隨后Ding等[41]又將這株鏈霉菌放在大米固體中培養(yǎng)發(fā)酵,從其培養(yǎng)提取物中分離出新的全霉素衍生物(35)和2個(gè)新的環(huán)丙烷乙酸衍生物(36、37)。

1.2 培養(yǎng)條件的改變

微生物在培養(yǎng)過(guò)程中的外界環(huán)境如溫度、pH、曝氣、容器類型等因素都會(huì)影響微生物基因表達(dá),因而對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成有著顯著的影響。最早在2002年,Bode等[6]通過(guò)改變外界培養(yǎng)參數(shù)(如曝氣、溫度、pH、培養(yǎng)容器),從6種不同的微生物中分離出100多種化合物,分屬于25種以上不同的結(jié)構(gòu)類型。

1.2.1 溫度

次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生直接受微生物酶活性的影響,溫度過(guò)高導(dǎo)致酶失活,溫度過(guò)低則會(huì)影響酶促反應(yīng)速率。鏈霉菌S.peucetiusDM07以生產(chǎn)重要的蒽環(huán)類藥物而聞名,在同一培養(yǎng)基中,Pham等[42]將菌株在不同溫度下(18、23、28和37 ℃)培養(yǎng)72 h,發(fā)現(xiàn)在18 ℃培養(yǎng)條件下的產(chǎn)物于17.5 min出現(xiàn)新峰,而在其他的溫度下該峰不存在,通過(guò)進(jìn)一步的分離與純化得到1個(gè)新型大環(huán)內(nèi)酯類化合物peucemycin(38)(見(jiàn)圖3和表1)。

圖3 化合物38～71結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of compounds 38-71

1.2.2 曝氣或溶氧量

含氧量的變化可以影響生化反應(yīng),進(jìn)而調(diào)控代謝途徑,激活不同的基因簇。鏈霉菌Streptomycessp.Go40/14所有的代謝產(chǎn)物都可以通過(guò)改變發(fā)酵罐體積、培養(yǎng)基組成或曝氣程度分離獲得,化合物39～43幾乎在所有的條件下都能獲得;而化合物44和45只能在特殊的發(fā)酵罐得到;化合物46～49可通過(guò)高曝氣獲得;化合物50只能在體積超過(guò)90L、高曝氣的發(fā)酵罐中得到[6]。Gallagher等[43,44]用海洋來(lái)源的鏈霉菌Streptomycessp.CNQ-525來(lái)探究氧氣濃度對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物生成的影響,當(dāng)在低氧環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí),觀察到萜類化合物napyradiomycin(51)的產(chǎn)量減少,而另外1個(gè)萜類化合物的中間體8-amino-flaviolin(52)大量增加。S.parvulusTu64在常規(guī)培養(yǎng)條件下的主要代謝產(chǎn)物為聚酮類化合物manumycin A(53),同時(shí)伴有manumycins B～D(54～56)的產(chǎn)生,但隨著壓力以及溶氧量的增加,導(dǎo)致該菌產(chǎn)生了20個(gè)新的聚酮類化合物manumycin或manumycin類似物,這里僅列出來(lái)2種(57、58)[6]。

1.2.3 鹽度、pH

鹽度、pH與溫度一樣都是微生物生理生化保持穩(wěn)定的一個(gè)重要因素。微生物暴露在添加不同鹵素的培養(yǎng)基中,可能會(huì)激活隱秘的生物合成基因簇,產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。Streptomycessp.DSM 14386在含1.5% NaCl的培養(yǎng)基中產(chǎn)生5個(gè)新型的環(huán)肽類化合物Svetamycins A～E(59～63),在含1.5% NaBr的培養(yǎng)基中產(chǎn)生2個(gè)溴化同源物Svetamycins F、G(64、65),這些物質(zhì)均在常規(guī)培養(yǎng)基中未被發(fā)現(xiàn)[45,46]。培養(yǎng)環(huán)境pH通過(guò)影響酶的活性及膜表面的帶電性質(zhì),改變底物的進(jìn)出速率與進(jìn)出方式,進(jìn)而影響基因簇的表達(dá)。Streptomycessp.A1在pH為微酸的情況下產(chǎn)生雙苯并螺環(huán)縮酮類化合物Rubromycins(66～69),當(dāng)環(huán)境pH為7.3時(shí),則會(huì)產(chǎn)生化合物70和71[6]。Sakar等[47]從靠海附近的濕潤(rùn)環(huán)境中分離到一株Streptomycessp.MS1/7,并報(bào)道了pH對(duì)該菌次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)其在酸性(pH 4.0)培養(yǎng)基中沒(méi)有抗菌活性,pH大于7.0表現(xiàn)出一定的活性,pH=10.0時(shí)仍表現(xiàn)出抗菌活性,但是在pH為9.0時(shí)抗菌活性最高。

1.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化策略

在改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件的激活策略中,培養(yǎng)條件的優(yōu)化可以通過(guò)一次次地修改某個(gè)單一因素來(lái)實(shí)現(xiàn),也可以基于更復(fù)雜的數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)方法來(lái)幫助實(shí)現(xiàn),即人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network,ANN)、遺傳算法(genetic algorithm,GA)、響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)等[48]。RSM方法是Box等[49]開(kāi)發(fā)的一種使用因子設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化所需代謝物的生產(chǎn)過(guò)程,常用于優(yōu)化配方變量和優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程。Managamuri等[50]對(duì)S.sparsusVSM-30培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化,包括孵育時(shí)間、溫度、pH、碳氮源等,實(shí)現(xiàn)抗真菌、抗細(xì)菌和抗氧化等活性物質(zhì)的增加。在另一項(xiàng)研究中,Singh等[51]應(yīng)用ANN與GA結(jié)合的方法優(yōu)化了S.triostinicus的培養(yǎng)基組分,并從該菌種分離到放線菌素V,該菌株在先前并沒(méi)有檢測(cè)此類抗生素的產(chǎn)生,且應(yīng)用ANN/GA獲得的抗生素產(chǎn)量比RSM獲得的產(chǎn)量高36.7%。

2 共培養(yǎng)策略

傳統(tǒng)微生物天然產(chǎn)物的生產(chǎn)通常是在一個(gè)營(yíng)養(yǎng)豐富的單一培養(yǎng)基中完成的,這些培養(yǎng)基雖然有效,但是與細(xì)菌原始、復(fù)雜且貧瘠的環(huán)境相比有著明顯的區(qū)別[52]。共培養(yǎng)體系是激活沉默生物合成基因簇、刺激新型次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的有效策略之一,其主要通過(guò)模擬種間爭(zhēng)奪養(yǎng)分、空間等條件時(shí)所遇的生存壓力來(lái)分析微生物形態(tài)變化、監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度等,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化[53]。根據(jù)培養(yǎng)基狀態(tài)的不同可以分為液體共培養(yǎng)(混合發(fā)酵)和固體共培養(yǎng)[10]。根據(jù)共培養(yǎng)微生物的類型,我們可以分為:鏈霉菌與鏈霉菌共培養(yǎng)、鏈霉菌與非鏈霉菌共培養(yǎng)兩大類[54]。

2.1 鏈霉菌與鏈霉菌共培養(yǎng)

Yamanaka等[55]對(duì)76株鏈霉菌的交叉共培養(yǎng)證明,20%以上的鏈霉菌在共培養(yǎng)條件下表現(xiàn)為菌株長(zhǎng)勢(shì)迅速且次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量增加。鐵色素類化合物去鐵胺(desferrioxamine E)(72)(見(jiàn)圖4)是從S.griseus培養(yǎng)液上清中分離純化的一種鐵載體,它與鏈霉菌生長(zhǎng)及相關(guān)生物產(chǎn)品的產(chǎn)生有關(guān)。將該菌與不同鏈霉菌菌株共培養(yǎng),使鏈霉菌出現(xiàn)不同程度的次級(jí)代謝產(chǎn)物增加或形態(tài)分化。當(dāng)S.griseus與S.coelicolorA3(破壞了鐵載體合成基因簇,單獨(dú)不可培養(yǎng))共培養(yǎng)時(shí),S.coelicolorA3恢復(fù)正常生長(zhǎng),表明了desferrioxamine E在鏈霉菌的生存發(fā)育中起到一定的作用[55]。S.colicolorM145與其他鏈霉菌(Streptomycessp.E14、Streptomycessp.SPB74等)相互作用時(shí),至少產(chǎn)生了12個(gè)不同的去鐵胺[56]。

圖4 化合物72～75結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of compounds 72-75

Promomycin(73)是在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的可以促進(jìn)抗生素生產(chǎn)的聚醚類化合物,結(jié)構(gòu)上與lonomycin(74)相關(guān),本身具有抗菌活性。將產(chǎn)生這種物質(zhì)的鏈霉菌與不同的鏈霉菌(常規(guī)培養(yǎng)未有抗生素類物質(zhì)產(chǎn)生)共培養(yǎng),均有抗生素物質(zhì)產(chǎn)生[57]。S.lividans是兩種紅色素的生產(chǎn)者,但這些色素的產(chǎn)生需要具備一定的條件,在實(shí)驗(yàn)室正常培養(yǎng)條件下,并不會(huì)產(chǎn)生這些色素,需要在一種激素類似物(75)的刺激下才可以產(chǎn)生[58]。Onaka等[58]將從土壤中分離出的400個(gè)放線菌用于刺激S.lividans的生長(zhǎng),將Streptomycessp.TP-A0584與目標(biāo)菌種共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)S.lividans產(chǎn)生紅色素,后經(jīng)分離得到1個(gè)新的多肽類抗生素goadsporin,低濃度的goadsporin具有促進(jìn)孢子形成的作用,高濃度則會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)。

2.2 鏈霉菌與非鏈霉菌共培養(yǎng)

2.2.1 鏈霉菌與細(xì)菌

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等人類致病菌一直是實(shí)驗(yàn)室篩選具有生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的指示菌株。最近幾十年發(fā)現(xiàn),這些致病菌在通過(guò)共培養(yǎng)方式來(lái)激活沉默基因簇方面具有優(yōu)勢(shì),因而一直嘗試將它們與放線菌共培養(yǎng),尤其是鏈霉菌屬[59]。

Bing等[60]發(fā)現(xiàn)Streptomycessp.FXJ2.014單一培養(yǎng)主要產(chǎn)生的生物活性代謝產(chǎn)物是醌霉素(quinomycin A),將其與枯草芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)可產(chǎn)生1個(gè)新的醌霉素結(jié)構(gòu)類似物quinomycin FXJ2.014-HB,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,這種新產(chǎn)生的醌霉素具有成為低細(xì)胞毒性抗生素的潛力。Daniel等[61]將一株海洋來(lái)源的鏈霉菌與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的環(huán)肽類化合物dentigerumycin E,檢測(cè)了dentigerumycin E(76)及其化學(xué)衍生物(77、78)生物活性,發(fā)現(xiàn)dentigerumycin E具有抗人類癌細(xì)胞增殖活性(見(jiàn)圖5、表2)。

表2 共培養(yǎng)挖掘新的活性代謝產(chǎn)物Table 2 Co-culture mining for new active metabolites

圖5 化合物76～107結(jié)構(gòu)Fig.5 Structures of compounds 76-107

Sung等[62]從紅樹(shù)林根部分離到一株鏈霉菌Streptomycessp.PTY08712,通過(guò)分析其基因組發(fā)現(xiàn)該菌株具有產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的強(qiáng)大潛力。使用多種培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),在其提取物中發(fā)現(xiàn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,與基因組數(shù)據(jù)顯示的潛在的次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類相比存在巨大的偏差。后將其與枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)共培養(yǎng),該菌株中的沉默生物合成基因簇被激活,granaticin、granatonmycin D 和 dihydrogranaticin 等3種抗生素產(chǎn)量增加。單一培養(yǎng)S.coelicolorA3時(shí)會(huì)產(chǎn)生少量三吡咯色素類化合物undecylprodigiosin,Mavituna等[63]將該鏈霉菌與大腸桿菌共培養(yǎng),最終undecylprodigiosin的產(chǎn)量有顯著增加。

Burkholderiavietnamiensis(ATCC BAA-248)、Brucellaneotomae(ATCC 23459),Yersiniapestis(A1122)和Xanthomonasaxonopodis(ATCC 8718)均為變形桿菌,與鏈霉菌(Streptomycessp.Bo33)共培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生1個(gè)新型的醌類天然抗生素resistomycin,對(duì)菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)均未檢測(cè)到該物質(zhì)的產(chǎn)生[64]。

2.2.2 鏈霉菌與真菌

真菌是一類龐大的群體,人們已經(jīng)從真菌發(fā)現(xiàn)了大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物[65],并且許多次級(jí)代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出生物活性,因而具有重大的藥物開(kāi)發(fā)潛力[66]。目前,最成功的共培養(yǎng)方法可能涉及到與各種真菌的共培養(yǎng),由于許多真菌與放線菌在不同的生態(tài)環(huán)境中共存,這意味著他們之間存在著普遍的相互作用[67](見(jiàn)圖5和表2)。

Rateb等[68]報(bào)道將S.bullii與AspergillusfumigatusMBC-F1-10分別接種在麥芽提取物培養(yǎng)基,在LC-MS色譜圖中幾乎看不到任何占主導(dǎo)地位的峰,用相同的培養(yǎng)基將兩者共同培養(yǎng),其LC-MS譜圖非常復(fù)雜,最后經(jīng)過(guò)分離鑒定,得到7個(gè)新型的生物堿類化合物(79～85)。Schroeckh等[69]將印尼曲霉A.nidulans與S.hygroscopicus共培養(yǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生4個(gè)新型的聚酮類化合物(86～89),這是在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)未曾發(fā)現(xiàn)的。

在Yu等[70]的研究中,以S.rocheiMB037和Rhinocladiellasimilis35進(jìn)行共培養(yǎng),并以兩株菌的單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照。從培養(yǎng)液中成功分離出2個(gè)新型的大環(huán)內(nèi)酯類化合物borrelidins J、K(90、91),以及三種已知的大環(huán)內(nèi)酯類化合物(92～94),且化合物90、91僅在共培養(yǎng)中被檢測(cè)到。Wang等[71]將Penicilliumsp.WC-29-5與S.fradiae007共培養(yǎng),從培養(yǎng)液中共分離出5個(gè)新型的聚酮類化合物(95～99),其中化合物deoxyfunicone(95)、交鏈孢酚 alternariol (96)、(9R,14S)-epoxy-11-deoxyfunicone(98)、(9S,14R)-epoxy-11-deoxyfunicone(99),僅在共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),且化合物98和99表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性活性。

TsukamurellapulmonisTP-B0596是一種含霉菌酸的真菌,與S.lividans共培養(yǎng)能誘導(dǎo)紅色素的產(chǎn)生。Onaka等[72]將112株鏈霉菌與TsukamurellapulmonisTP-B0596共培養(yǎng),經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)其中41個(gè)菌株誘導(dǎo)了新的次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生,如新型聚酮類抗生素alchivemycin A(100)。

鏈霉菌與非鏈霉菌共培養(yǎng)時(shí),兩者的關(guān)系并不是一成不變的。鏈霉菌既可以是生產(chǎn)者也可以是誘導(dǎo)者。如Wakefield等[73]將一株源自海洋的真菌AspergillusfumigatusMR2012與高干旱沙漠分離的S.leeuwenhoekiiC34共培養(yǎng)來(lái)研究?jī)烧叩南嗷プ饔谩Ｕ婢鶰R2012與鏈霉菌C34共培養(yǎng)導(dǎo)致許多新化合物產(chǎn)生,其中包括真菌來(lái)源的6個(gè)新型的生物堿類化合物brevianamide X(101)、brevianamide F(102)、terezine D(103)、luteoride D(104)、pseurotin G(105)、11-O-methy pseurotin A(106),這是該真菌在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)從未檢測(cè)到的;除了在鏈霉菌C34檢測(cè)到的代謝物外,共培養(yǎng)條件下分離出1個(gè)新型的環(huán)肽類化合物chaxapeptin(107),這也是單獨(dú)培養(yǎng)未檢測(cè)到的。

3 添加化學(xué)激發(fā)子

化學(xué)激發(fā)子是小分子物質(zhì),當(dāng)添加到培養(yǎng)基中時(shí)可誘導(dǎo)微生物生物合成基因簇的表達(dá)并產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物[74]。在自然界中,鏈霉菌生活在比較復(fù)雜的環(huán)境之中,周圍常存在細(xì)菌、真菌、動(dòng)物和植物,為了解決本身生存問(wèn)題,其會(huì)產(chǎn)生大量化學(xué)信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)自己與四周環(huán)境的適應(yīng)性,從而滿足特定合成基因的調(diào)控表達(dá)機(jī)制,以便其更好地生存[75](見(jiàn)圖6、表3)。

表3 添加化學(xué)激發(fā)子發(fā)現(xiàn)新的活性代謝產(chǎn)物Table 3 Addition of chemical excitons to discover new active metabolites

圖6 化合物108～118結(jié)構(gòu)Fig.6 Structures of compounds 108-118

有報(bào)道稱,大多數(shù)激發(fā)子是抗生素,它們能在較低的濃度下誘導(dǎo)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[76]。如前面提到的從一株鏈霉菌中分離得到的抗生素goadsporin,低濃度(<1 μmol/L)的goadsporin能刺激鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的增加;高濃度的goadsporin則會(huì)抑制細(xì)胞的增殖[58]。Etoposide(108)和ivermectin(109)是已知的抗生素,在低濃度下均可以誘導(dǎo)次級(jí)代謝產(chǎn)物的增加[41]。S.coelicolor能生產(chǎn)undecylprodignine(110)、streptorubin B(111)等色素型次級(jí)代謝產(chǎn)物[77,78]。為了確定干擾次級(jí)代謝的小分子,Craney等[79]篩選了30569種小分子,以鏈霉菌在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)期間色素的沉著能力作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果觀察到有112種小分子有色素沉著能力,其中19種小分子表現(xiàn)出較好的效果。19個(gè)小分子中有4個(gè)具有相似的結(jié)構(gòu):ARC2、ARC3、ARC4和ARC5,稱為ARC2系列。在實(shí)驗(yàn)中,將購(gòu)買的ARC2(112)及其ARC2衍生物Cl-ARC2用于多種鏈霉菌中,成功誘導(dǎo)出1個(gè)苯并異色烷醌類化合物(113)、1個(gè)三吡咯色素類化合物(114)以及3個(gè)不飽和內(nèi)脂類化合物(115～117)[14,74,79,80]。

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是一類重要的酶,負(fù)責(zé)從組蛋白的N端尾部去除乙酰基團(tuán)[81]。組蛋白的N端通過(guò)添加/去除小基團(tuán)如甲基、乙酰基或磷酸基團(tuán)來(lái)修飾,這些修飾可以影響基因的轉(zhuǎn)錄[82]。鏈霉菌屬于原核生物,沒(méi)有組蛋白可以供DNA附著,HDAC抑制劑對(duì)細(xì)菌的研究較少。在一項(xiàng)初步研究中,Moore等[81]研究了HDAC抑制劑對(duì)S.coelicolorA3次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)在兩種固體培養(yǎng)基中進(jìn)行,正常情況下R5培養(yǎng)基會(huì)產(chǎn)生兩種色素且產(chǎn)量正常,MM培養(yǎng)基則會(huì)降低兩種色素的產(chǎn)量。當(dāng)加入一定體積的丁酸鈉(sodium butyrate,一種典型的HDAC抑制劑)會(huì)使MM培養(yǎng)基上色素的產(chǎn)量增加,而R5培養(yǎng)基上的色素產(chǎn)量降低。隨后使用不同的HDAC抑制劑,得出了相似的結(jié)果。在液體培養(yǎng)基中,加入丁酸鈉,通過(guò)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)S.coelicolorA3中5個(gè)公認(rèn)的沉默基因被表達(dá)[81]。

稀土金屬也是一類激發(fā)因子,最近的研究證明,其在刺激沉默基因簇產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物方面也相當(dāng)有效果[83]。如Xu等[84]在正常培養(yǎng)基中添加LaCl3用于培養(yǎng)來(lái)自于深海的50株放線菌,其中有15株由于添加了LaCl3導(dǎo)致抗病原菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量增加,并檢測(cè)到新的環(huán)肽類化合物如uranchimycin D(118)。此外,糖、金屬離子等也可以作為激發(fā)子觸發(fā)沉默基因簇表達(dá)[23,32,85]。

總之,無(wú)論選擇哪種激發(fā)子進(jìn)行誘導(dǎo),其優(yōu)勢(shì)都是明顯可見(jiàn)的。同時(shí)添加激發(fā)子是最簡(jiǎn)單、最具有成本效益的方式,當(dāng)然缺點(diǎn)也是明顯的,激發(fā)子過(guò)多過(guò)少都會(huì)造成一定的影響,過(guò)多會(huì)造成微生物的直接死亡,過(guò)少則表現(xiàn)為沒(méi)有影響,因此使用時(shí)需要選擇合適的激發(fā)子的濃度[74]。

4 全局性調(diào)控

鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物可以通過(guò)多種復(fù)雜的代謝途徑合成,且相關(guān)基因的表達(dá)往往要受到極為嚴(yán)格的調(diào)控[86]。其中,全局性調(diào)控是指在全局性調(diào)控因子的作用下發(fā)揮的調(diào)控作用,該因子不屬于任何一個(gè)基因簇,在特定的環(huán)境條件下,可同時(shí)誘導(dǎo)多個(gè)基因的表達(dá),還可以影響形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生長(zhǎng)發(fā)育[87]。

天藍(lán)色鏈霉菌bld基因是全局性調(diào)控中第一個(gè)被描述的,該基因的突變會(huì)導(dǎo)致抗生素合成的中斷以及生長(zhǎng)發(fā)育停止。早在2000年,天藍(lán)色鏈霉菌中就有超過(guò)10個(gè)bld基因被鑒定,這些基因調(diào)控著不同的產(chǎn)物[88],其中bld A基因是bld基因中研究最多的,其通過(guò)調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄,從而控制次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[89]。同時(shí)研究者在其他鏈霉菌的基因組中也發(fā)現(xiàn)了bld基因的同源基因,逐漸被用于鏈霉菌沉默基因簇的激活[90]。除了bld基因外,目前還有nsdA[91]、farR1[92]、abrC1/C2/C3[93]、SCB1,2,3[94]、adpA[95]、crp[96]等全局性調(diào)控因子用于鏈霉菌沉默基因簇的激活。

5 總結(jié)

抗生素的發(fā)現(xiàn)是醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的重大里程碑,極大地降低了病菌感染的發(fā)生率和死亡率。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素類約60%的是由鏈霉菌產(chǎn)生,然而,隨著抗生素的大量使用,耐藥性及超級(jí)細(xì)菌問(wèn)題同樣日益突出[1]。為了應(yīng)對(duì)耐藥性以及超級(jí)細(xì)菌的這一問(wèn)題,我們急需挖掘新的抗生素。通過(guò)對(duì)鏈霉菌基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)存在著很大一部分的基因處于沉默狀態(tài)[5]。因而,鏈霉菌中沉默基因簇的激活是當(dāng)下重要的問(wèn)題之一。越來(lái)越多的學(xué)者注意到了鏈霉菌發(fā)現(xiàn)新化合物的潛力,開(kāi)始研究如何刺激沉默基因簇的激活。

根據(jù)激活的目標(biāo)基因是否明確,我們將目前的激活策略分為定向激活策略和非定向激活策略。非定向激活策略包括改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件的激活策略、共培養(yǎng)策略、添加化學(xué)激發(fā)子和全局性調(diào)控等,與一些基于基因的手段如核糖體工程、啟動(dòng)子工程、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等相比,非定向激活策略有著自身的優(yōu)勢(shì)及局限性(見(jiàn)表4)。近些年,一些新的、前沿的手段被研發(fā),如微流體平臺(tái)[14]、微發(fā)酵與基因組尺度的代謝模型結(jié)合[97]、生物發(fā)生管與組學(xué)相結(jié)合[98]、HiTEs[99]等,在激發(fā)沉默基因簇中起著巨大的作用。將非定向激活策略與代謝物指紋圖譜分析結(jié)合已證明在挖掘次級(jí)代謝產(chǎn)物中取得重大成果[100]。

表4 非定向沉默基因簇激活策略的優(yōu)缺點(diǎn)Table 4 Advantages and disadvantages of non-directed strategies for activating silent gene clusters

本文僅僅是對(duì)改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件的激活策略、共培養(yǎng)策略以及添加化學(xué)激發(fā)子策略進(jìn)行簡(jiǎn)單的概括,未涉及或僅涉及到很少一部分基因?qū)用娴募夹g(shù)。目前,無(wú)論是非定向激活策略還是定向激活都有各自的優(yōu)勢(shì)及局限性,單獨(dú)使用某一種策略很難全面激活沉默基因簇。因此,在基因組測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步的前提下,將基礎(chǔ)微生物學(xué)方法、計(jì)算方法和技術(shù)創(chuàng)新等更徹底地結(jié)合起來(lái),將更有助于發(fā)現(xiàn)鏈霉菌巨大的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力。