基于性狀-顯微-指紋圖譜的紅芪搓條與未搓條樣品比較研究

王 燕,強正澤,賈妙婷,魏小成,王明偉,李 碩,李成義

甘肅中醫藥大學,蘭州 730000

紅芪(Hedysari Radix)又名獨根、黑芪、綿芪,是甘肅主產特色藥材之一,來源于豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根[1]。商品紅芪以栽培為主,主要分布于甘肅隴南、定西地區,其中武都米倉山一帶所產紅芪享有“米倉紅芪”之美譽。產地加工是藥材綜合品質形成的重要環節,其歷史可追溯至東漢時期。《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中規定紅芪的加工方法為“春、秋二季采挖,除去須根和根頭,曬干”。隨著中國紅芪之鄉的產生及紅芪產業的發展,武都等道地產區形成了獨具特色、較為系統的產地加工方法和技術體系。經實地調研,紅芪藥材的產地加工方法為:春、秋二季采挖,除凈泥土,去除須根和根頭,曬至半干,鮮皮柔軟時捆成小把進行搓條2～3次,使其皮肉緊貼,條直,邊曬邊搓,晚上堆積發汗,直至全干。與《中國藥典》所載加工方法比較,增加了“搓條”環節,而且揉搓是紅芪成為“束黃芪”的關鍵步驟。通過“搓條”不僅及時排除鮮紅芪藥材中的水分,防止紅芪藥材產生質地松泡等現象,而且使藥材變得緊實、油潤、柔軟,保證了藥材的質量。因此闡釋紅芪搓條加工的科學內涵對道地性特征的轉化應用具有實際意義。

查閱文獻及實地調查發現,揉搓或搓條加工的中藥材有紅芪[2,3]、蒙古黃芪[4]、白條黨參、素花黨參、川黨參[5-7]、八仙黨參[8]、洛黨參[9]、房黨[10]、潞黨參[11]、三七、光山藥[2,7]等,說明需要“揉搓”加工的藥材具有一定的普遍性,解析紅芪等藥材搓條加工的科學內涵是其質量控制的關鍵問題。紅芪原產地加工存在搓條與發汗兩種獨具特色的工藝相結合的特征,加工過程需重復兩種工藝直到加工完全為止,其科學問題涉及力學、溫度等內容,為控制實驗變量,研究產地加工對紅芪質量的影響,實驗設計優先考慮了搓條工藝。為此,采用性狀描述、掃描電鏡、顯微鑒別及指紋圖譜等方法比較了搓條與未搓條紅芪樣品的差異性,研究搓條與紅芪質量間的關系,為闡釋紅芪搓條加工的科學內涵提供科學支撐。

1 實驗材料

1.1 供試材料

2014年采集樣品28份,其中野生樣品12份,栽培樣品15份,商品藥材1份(搓條),樣品采集后野生與栽培紅芪的每份樣品分為2類(搓條與未搓條);2017年樣品1份(Z-16),分為3類(鮮品,搓條,未搓條),樣品信息見表1,共得到搓條樣品29份、未搓條樣品28份、鮮品1份。樣品搓條加工方法:通過實地采樣模擬紅芪產地搓條方法,即采集紅芪鮮品后(約3 kg),初步抖去泥土,裝入已寫好編號的塑料袋中。帶回實驗室后取出樣品攤晾,至水分達50%左右時開始搓條:共搓條5次(隔三天搓一次),每次揉搓20次(一次搓一根樣品),完成后陰干。未搓條樣品直接陰干。樣品晾干后,用粉碎機粉碎,過65目篩,裝入自封袋密封備用。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

電子顯微鏡(型號:BX51-32H01);高效液相色譜儀(型號:Agilent 1260型);Tescan V5掃描電子顯微鏡(捷克TESCAN公司)。

1.2.2 試劑

無水乙醇、水合氯醛、稀甘油、70%甲醇、0.1%磷酸、乙腈(天津市大茂化學試劑廠,批號:151201,色譜純);甲醇(天津市大茂化學試劑廠,批號:151026,分析純;批號:151123,色譜純);磷酸(天津市凱信化學工業有限公司,優級純);水(娃哈哈純凈水);芒柄花素對照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號:MUST-13080501,純度≥99 %);紅芪對照藥材(中國食品藥品檢定研究院,批號:121103-201103)。

2 方法與結果

2.1 水分測定

采用2020年版《中國藥典》(四部)水分測定法項下,烘干法測定[12],平行三次,并計算數據,樣品水分數據見表2。采用單因素方差分析,比較了搓條與未搓條樣品水分的差異性(見表3),發現搓條與未搓條樣品水分含量之間差異性不顯著(P=0.170 8>0.05)。

表2 水分測定結果Table 2 The results of moisture content

表3 搓條與未搓條樣品水分含量的單因素方差分析Table 3 One-way ANOVA for moisture content of rubbed and unrubbed samples

2.2 性狀比較研究

參考2020版《中國藥典》(一部)紅芪項下的藥材性狀的描述內容[1],對野生、栽培紅芪搓條與未搓條樣品之間的表面性狀、顏色、質地、斷面、氣味等進行了比較,提取了搓條及未搓條樣品的個性特征信息,總結了搓條與未搓條樣品之間的差異性(見表4、圖1)。

圖1 搓條與未搓條藥材樣品對比Fig.1 Comparison of rubbed and unrubbed samples注:A:搓條樣品;B:未搓條樣品。Note:A:Rubbed samples;B:Unrubbed samples.

表4 搓條與未搓條樣品性狀特征Table 4 Characteristics of rubbed and unrubbed samples

2.3 基于掃描電鏡的藥材比較研究

一級紋理、二級紋理及皮孔等特征屬于藥材的微性狀特征之一,是藥材品質形成過程產生的產物,與藥材的品質具有相關關系。在性狀比較的基礎上,選取部分藥材樣品,切取搓條與未搓條藥材樣品的表皮置于掃描電鏡(10 kV加速電壓)下觀察,比較二者的一級紋理、二級紋理及皮孔的差異性(見圖2),發現搓條與未搓條樣品均具有一級紋理、二級紋理及皮孔,其差異主要存在于一級紋理及皮孔上。圖2中紅芪樣品一級紋理、二級紋理及皮孔比較發現,搓條樣品一級紋理較為細膩,藥材表面溝壑較小、淺,而未搓條樣品一級紋理較為粗糙,溝壑較大、深,搓條樣品的皮孔大多數較平,未搓條樣品的皮孔大多數凸出藥材表面,可能與紅芪搓條加工過程中藥材表面受到揉搓力有關。二級紋理是將紅芪藥材表面特征放大后觀測的特征,搓條與未搓條樣品均呈現出網狀的紋理,特征相似,因此二者在二級紋理特征上差異性較小。

圖2 搓條與未搓條一級紋理、二級紋理及皮孔比較Fig.2 Primary textures,secondary textures,lenticels of rubbed and unrubbed samples

2.4 顯微鑒別研究

顯微特征是鑒定和表征中藥材品質的重要參考依據,其與中藥材的成分及品質具有密切關系。分別選取Z-02、Z-03、Y-04、Y-09、Y-12的搓條與未搓條樣品及S-01-CT商品藥材粉末,用解剖針挑取少量粉末于載玻片上,滴加稀甘油1～2滴(或滴加水合氯醛于酒精燈上進行透化,再滴加稀甘油1～2滴),用鑷子蓋上蓋玻片,在顯微鏡下進行觀察。同時選取Z-16等樣品,分離木栓層組織,滴加稀甘油1～2滴后于顯微鏡觀察,比較搓條與未搓條紅芪樣品之間表皮組織的差異性。

通過比較搓條與未搓條樣品(見圖3)導管、薄壁細胞、晶體(方晶)、晶鞘纖維、淀粉粒、木栓細胞等顯微特征發現,搓條與未搓條樣品間搓條樣品單粒淀粉及復粒淀粉較多,且形態較為明顯,而未搓條樣品淀粉粒大多數聚集在一起,單粒淀粉及復粒淀粉較少,可能與樣品搓條加工過程中揉搓力的擠壓效應有關;二者間導管類型多為環紋、具緣紋孔等,差異性較小或不明顯;薄壁細胞呈類圓形,細胞形態差異性較小或不明顯;晶體大多為方晶,形態特征未發生明顯變化;晶鞘纖維大多為纖維與方晶的結合體,二者間差異性不明顯;木栓細胞形態二者間具有差異性,搓條樣品木栓細胞排列較為整齊,細胞形態大多呈長方形,而未搓條樣品木栓細胞無序排列,細胞形態呈不規則狀態,出現這種差異性的原因可能與搓條樣品在揉搓過程中受到揉搓機械力的作用有關。因此,搓條與未搓條樣品間的導管、薄壁細胞、晶體(方晶)、晶鞘纖維的差異性較小或在此條件下不能夠表征出二者之間的差異性,二者間的差異性主要表現在淀粉粒的存在狀態與木栓細胞形態,搓條樣品單粒淀粉及復粒淀粉較多,且形態較為明顯,未搓條樣品淀粉粒大多數聚集在一起,單粒淀粉及復粒淀粉較少;搓條樣品木栓細胞排列較為整齊,細胞形態大多呈長方形,而未搓條樣品木栓細胞排列無序,細胞形態不規則。

圖3 搓條與未搓條樣品顯微特征Fig.3 Microscopic features of rubbed and unrubbed samples

2.5 指紋圖譜研究

2.5.1 指紋圖譜條件

指紋圖譜是能夠反映中藥整體性化學特征的重要研究技術。此部分內容是在課題組前期建立的指紋圖譜方法學基礎上開展的[13]。指紋圖譜條件見表5。

表5 TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)流動相組成Table 5 TC-C18(2) column (250 mm×4.6 mm,5 μm) mobile phase

2.5.2 樣品處理及制備

精密稱取搓條與未搓條樣品粉末3 g,置于錐形瓶(150 mL)中,用移液管加入30 mL 甲醇,水浴(80 ℃)回流1 h,回流結束后放置室溫,抽濾處理,濾液水浴蒸發至近干,放冷后用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶。進樣時用0.45 μm濾膜過濾至進樣瓶中,即為供試樣品溶液,每份樣品平行3次。

2.5.3 線性關系考察

此部分實驗是在課題組前期建立的質量評價體系的基礎開展的,因此為保持研究工作的系統性及可對照性,沿用了前期建立的芒柄花素回歸方程:濃度(μg/mL)為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,Y=60.769X-9.063 9,r2=0.999 9,線性范圍為0.810～218.700 μg/mL。

2.5.4 精密度試驗

取S-01-CT樣品液,連續進樣6次,按“2.5.1”項下色譜條件測定芒柄花素峰面積,其峰面積積分值的RSD值為1.14%,表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩定性試驗

取S-01-CT樣品液,于室溫下放置,分別于0、4、8、12、20、24 h進樣檢測,按芒柄花素成分的峰面積積分值分別計算其RSD值。結果該樣品中芒柄花素RSD值為0.72%,表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5.6 重復性試驗

精密稱取S-01-CT粉末6份,按“2.5.2”項下方法制成6份供試品溶液,按“2.5.1”項下色譜條件分別測定。結果該樣品中芒柄花素的RSD值為0.76%,表明該測定方法重復性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知芒柄花素含量的S-01-CT樣品9份,每份約1.0 g,精密加入一定量的芒柄花素對照品,其加入量分別為該樣品中相應成分含量的80%(53.83 μg)、100%(67.29 μg)、120%(80.75 μg),按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.5.1”項下色譜條件測定。結果芒柄花素回收率的RSD值為2.52%。

2.6 芒柄花素含量測定

采用“2.5.2”項下樣品制備的方法制備搓條與未搓條樣品液,按照“2.5.1”指紋圖譜條件進樣,記錄芒柄花素峰面積,計算各樣品芒柄花素含量。

2.7 數據處理

以實驗中獲取的搓條與未搓條指紋圖譜為數據形成數據庫,并采用2004版中藥指紋圖譜相似度評價系統進行不同樣品間的相似度比較研究,并采用單因素方差分析比較二者芒柄花素含量的差異性。

2.8 結果分析

2.8.1 搓條與未搓條樣品相似度比較

以對照藥材為對照,計算了搓條與未搓條紅芪樣品的相似度(見表6),發現搓條與未搓條紅芪樣品相似度具有一定的差異性,大多數搓條樣品的相似度高于未搓條樣品的相似度,栽培搓條樣品的平均相似度為0.931,栽培未搓條樣品的平均相似度為0.893,野生搓條樣品的平均相似度為0.917,野生未搓條樣品的平均相似度為0.877。搓條與未搓條指紋圖譜共有模式圖見圖4,指紋圖譜匹配結果顯示,搓條樣品與未搓條樣品的共有峰為8個,其中8號峰為芒柄花素。

圖4 搓條與未搓條樣品HPLC指紋圖譜共有模式圖Fig.4 HPLC fingerprint common mode of rubbed and unrubbed samples注:A:指紋圖譜;B:共有峰。Note:A:HPLC fingerprint;B:Common peaks.

表6 搓條與未搓條樣品相似度Table 6 HPLC fingerprinting similarity of rubbed and unrubbed samples

2.8.2 搓條與未搓條樣品芒柄花素含量比較

在指紋圖譜建立的基礎上,測定了搓條與未搓條紅芪樣品芒柄花素含量(見表7),由表7可知,每個產地搓條樣品中芒柄花素的含量均高于未搓條樣品,野生搓條樣品均值為180.29±134.29 μg/g,未搓條樣品均值為69.81±25.41 μg/g,野生搓條樣品芒柄花素均值含量是未搓條樣品均值的2.58倍,栽培搓條樣品均值為129.64±55.55 μg/g,未搓條樣品均值為68.91±29.30 μg/g,栽培搓條樣品芒柄花素均值含量是未搓條樣品均值的1.87倍。同時單因素方差分析結果顯示(見表8),野生搓條與未搓條樣品的芒柄花素含量之間存在顯著性差異(P=0.01<0.05),栽培搓條與未搓條樣品的芒柄花素含量之間存在極顯著性差異(P=0.001<0.01),且混合樣品的搓條與未搓條樣品的芒柄花素含量之間存在極顯著性差異(P=0.000<0.01)。以上研究表明,紅芪搓條后增加了芒柄花素的含量。

表7 搓條與未搓條樣品芒柄花素含量Table 7 Formononetin content of rubbed and unrubbed

表8 搓條與未搓條樣品芒柄花素含量單因素方差分析Table 8 One-way ANOVA for formononetin content of rubbed and unrubbed samples

3 討論與結論

通過鑒定學研究發現,搓條樣品呈圓柱形,皮緊實且較為細膩,表面呈淺褐色,嚼之有豆腥味,味甜,聞之有濃烈的豆腥氣,斷面纖維性且粉性較強,質地堅硬,質密,不易折斷,揉搓過程須根容易干且易脫落,一級紋理較為細膩,藥材表面溝壑較小、淺,皮孔大多數較平,單粒淀粉及復粒淀粉較多,且形態較為明顯,木栓細胞排列較為整齊,細胞形態大多呈長方形;未搓條樣品呈不規則圓柱形,且具分支,皮松,易折斷,部分樣品折斷后顯中空的特征,并呈現出一定的柴性,縱皺紋較深,表面深褐色,嚼之、聞之豆腥味較淡或無,一級紋理較為粗糙,溝壑較大、深,未搓條樣品的皮孔大多數凸出藥材表面,淀粉粒大多數聚集在一起,單粒淀粉及復粒淀粉較少,木栓細胞無序排列,細胞形態呈不規則狀態。搓條與未搓條樣品的二級紋理、導管、薄壁細胞、晶體(方晶)、晶鞘纖維的差異性較小或在此條件下不能夠表征出二者之間的差異性。在指紋圖譜及芒柄花素含量方面,搓條與未搓條紅芪樣品相似度具有一定的差異性,搓條樣品相似度均值均高于未搓條樣品,搓條與未搓條紅芪樣品中芒柄花素含量具有顯著性差異,搓條樣品中芒柄花素的含量均高于未搓條樣品,野生搓條樣品芒柄花素均值含量是未搓條樣品均值的2.58倍,栽培搓條樣品芒柄花素均值含量是未搓條樣品均值的1.87倍。以上研究表明,搓條與未搓條樣品在性狀特征、一級紋理及皮孔、淀粉粒、木栓細胞、指紋圖譜相似度、芒柄花素含量等方面存在一定的差異性,且紅芪搓條后增加了芒柄花素的含量。

實地調查及實驗過程觀察發現,揉搓加工不僅是保證質量的關鍵步驟,而且揉搓加工涉及中藥材紅芪“分程變溫干燥(邊干燥邊揉搓)”過程等重要環節,其過程存在摩擦、受力等物理學的特征。中藥材有效成分普遍具有熱敏性、易氧化特性,揉搓及干燥過程受溫度影響,易引起外觀性狀、有效成分及生物活性的轉變,其物理性質(色澤、氣味、形態體積、微觀結構)和化學性質(多糖、黃酮、其他成分)等發生變化[14-16],因此揉搓干燥過程伴隨著藥材中水分減少、能量轉換及化學變化等現象的發生,采挖后的紅芪等中藥材在水分降至藥典規定值的過程是一個“緩慢代謝”的過程,隨著揉搓及干燥過程的進行,揉搓干燥過程對中藥材含水率的影響將打破中藥材內部化學成分和分子結構的動態平衡,導致其形態、微觀結構和有效成分發生變化[14]。水分降至一定程度后(揉搓干燥后),中藥材作為一個復雜的整體處于一個靜態平衡的過程,且藥材炮制加工為中藥飲片后,從一個平衡轉移至另一個平衡,或某些藥材保持著原來原藥材的平衡,可能與中藥經過配伍后煎煮的過程是一個能量變化與化學變化的過程的集合體且煎煮后形成了一個新的平衡體系具有相似之處。此外,紅芪產地加工中揉搓的環節主要以人工揉搓為主,因此揉搓機制及“揉搓機”的研制是未來研究的重要方向之一。

在揉搓機制方面,揉搓作為一種機械力或力學刺激,將力學信號施加于“緩慢代謝”的藥材表面,并將力學信號向藥材內部傳輸(表面至內部,細胞外至細胞內),引起藥材性狀、顯微特征、化學成分發生變化,其中化學成分的變化可能的原因是揉搓加工過程中紅芪藥材含有的芒柄花苷轉化或類黃酮成分轉化為芒柄花素引起的,其機制可能與以下假說有關:(1)力學信號影響植物細胞壁等組織結構,將胞外刺激轉導為胞內信號,引起組織結構或次生代謝產物發生變化[17]。(2)力學信號影響植物中機械敏感離子通道或感受機械力的機械蛋白。紅芪藥材中感受力學信號的“分子或結構”感知或力學信號通過植物中感受力學信號的遞質傳輸力學信號,引起機械敏感通道的開合,小分子物質之間相互交換或相互轉化,最終使次生代謝產物發生變化[18,19]。(3)力學信號刺激紅芪藥材中的電信號。植物電信號廣泛存在于植物體內,其具有快速的響應和傳導速度,藥材受刺激后調節紅芪在盡量短的時間內做出生理反應。間斷的力學信號可能引起中藥材中的電信號的變化,使其作出生理學反應,引起組織結構或次生代謝產物發生變化[20]。(4)揉搓的機械力施加于藥材后產生類似于“機械力化學”(機械力化學:在狹義上是指因機械力作用于固態物質,從而引起的化學反應,廣義上則是指由機械力所引發的一切化學現象)的變化,可能產生了熱效應或非熱的獨特效應(生成類等離子體和影響分子中的化學鍵)或力學信號作為一種機械能在植物體內通過某種裝置轉化為化學能使藥材的組織結構、次生代謝產物發生變化[21-23]。(5)揉搓的機械力施加于藥材后產生類似于“生物力學”的效應。揉搓藥材后產生的力學信號傳至細胞核,引起相關基因的表達或沉默[24],揉搓過程中力引起芒柄花素合成途徑(苯丙氨酸途徑)上關鍵酶基因(如異黃酮合酶基因等)的表達或沉默,引起次生代謝產物含量發生變化[25-27]。本文研究結果顯示,搓條后野生搓條樣品芒柄花素均值含量是未搓條樣品均值的2.58倍,栽培搓條樣品芒柄花素均值含量是未搓條樣品均值的1.87倍,可能的原因是搓條加工時藥材由鮮品至干品的過程受機械力刺激,機械力經過傳導,引起芒柄花素合成途徑上的關鍵異黃酮合酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因、肉桂酸羥化酶基因、香豆酸輔酶A連接酶基因、查爾酮合成酶基因等的表達或沉默,引起芒柄花素的含量升高,具體機制有待于進一步深入研究。

綜上所述,我們建立了“基于宏觀表型性狀--微觀結構特征--整體性化學特征解析的三維表征體系”,開展了基于性狀-顯微-指紋圖譜的紅芪搓條與未搓條樣品比較研究,發現了紅芪搓條前后性狀、顯微、指紋圖譜及活性成分均發生了顯著的變化,解析了揉搓加工的科學內涵。揉搓加工是保證紅芪質量及道地性形成不可或缺的步驟,是提高紅芪藥材活性成分含量的技術之一,可作為紅芪道地性特征應用的切入點,為其他藥材活性成分含量的提升提供思路。揉搓機制的研究需在中醫藥學結合物理學、化學、分子生物學、機械化學、生物力學、電生理學、結構生物學等學科的基礎上進一步深入研究。