基于BP-ANN結合CRITIC法優化當歸尾提取工藝參數

徐志偉,畢映燕,馮蕓梅,邊 娜,王寶才,李季文,杜偉鋒

1甘肅省中醫院,蘭州 730050;2蘭州市城關區白銀路街道衛生社區衛生服務中心,蘭州 730030;3浙江中醫藥大學中藥炮制技術研究中心,杭州 311401

當歸是傘形科植物當歸(Angelicasinensis(Oliv)Diels)的干燥根,是“根分梢理論”的代表藥材,臨床常用以治療血虛萎黃、眩暈心悸、月經不調、經閉痛經、虛寒腹痛、風濕痹痛、跌撲損傷、癰疽瘡瘍、腸燥便秘等癥[1]。傳統醫家認為當歸不同藥用部位應分別入藥,如“當歸頭止血上行,當歸身補血中守,當歸尾破血下流,全當歸補血活血”(李杲《脾胃論》)。項目組前期研究,當歸不同藥用部位兩兩配伍加熱回流提取(下簡稱“提取”)后,阿魏酸、綠原酸、歐前胡素、藁本內酯的百分含量和當歸尾藥材干膏率皆呈下降趨勢,表明有必要對當歸不同藥用部位開展分別應用與研究[2-4]。

文獻檢索發現,目前當歸的有關研究主要集中于當歸整體的研究,尚缺乏對當歸某一藥用部位的研究;此外,在臨床應用及生產實踐中,也多以當歸整體為對象開展相關工作,少有遵循古法,以當歸某一藥用部位為對象的情況;長此以往,既不利于中醫藥“傳承、創新”的發展原則,也不利于當歸全方位、深層次的研究。故本項目組擬以當歸尾為主要研究對象,選取其中阿魏酸等4種主要化學成分百分含量和當歸尾藥材干膏率為考察指標,選取提取次數、料液比、提取時間為考察因素,采用BP-ANN聯合CRITIC法系統研究當歸尾的提取工藝[5-7],優化相關工藝參數,以期建立當歸尾的最優提取工藝,為當歸尾后續深入研究提供數據支撐。

1 試驗用品

1.1 當歸尾的處理

當歸藥材采自甘肅隴西,經浙江中醫藥大學中藥炮制技術研究中心杜偉鋒副研究員鑒定為當歸正品藥材。按傳統要求,除去當歸根上端膨大、鈍圓,殘留葉鞘及莖基的當歸頭;以及外形呈圓柱狀的當歸身,即得當歸尾。

1.2 設備與試藥

PerkinElmer A-10型HPLC(PerkinElmer公司);普利賽斯LX2200C型百分之一和LX120A型萬分之一電子分析天平(普利賽斯國際貿易有限公司)。

阿魏酸標準品(批號:110773-201614)、綠原酸標準品(批號:110753-201817)、歐前胡素標準品(批號:111737-201910)、藁本內酯標準品(批號:111737-201910)皆從中國食品藥品檢定研究院購買,純度皆滿足試驗要求;甲醇、乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水。剩余試藥皆用分析純。

2 試驗流程及數據分析

2.1 化學成分檢測

2.1.1 配制樣品溶液

用萬分之一電子天平平行稱取當歸尾藥材9份,每50 g一份放入燒瓶中,移液管取一定量娃哈哈水,參照表1開展正交試驗。過濾提取液,回收溶劑至干,加色譜純甲醇溶解殘渣,收集至25 mL容量瓶,定容,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜即得。

表1 因素與水平Table 1 Factor and level

2.1.2 配制標準品溶液

萬分之一電子天平分別稱取阿魏酸等四種化合物標準品一定量,放入10 mL容量瓶,色譜純甲醇定容,搖勻,即得上述四種化合物標準品溶液;其質量濃度依次為0.73 mg/mL(綠原酸)、0.33 mg/mL(阿魏酸)、0.25 mg/mL(歐前胡素)和2 mg/mL(藁本內酯)。

2.1.3 色譜條件

采用Waters Symmetry Shield RP-C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)柱為色譜柱,DAD為檢測器,乙腈與0.1%磷酸水溶液為流動性,洗脫梯度為:0～10 min,12%→12%乙腈;10～15 min,12%→25%乙腈;15～22 min,25%→28%乙腈;22～25 min,28%→60%乙腈;25～30 min,60%→70%乙腈;30～40 min,70%→12%乙腈;流動相流量為1 mL/min,色譜柱溫度為25 ℃,檢測波長350 nm;每次進樣10 μL。標準品、樣品色譜峰見圖1。

圖1 混合標準品溶液(A)以及樣品溶液(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC of mixed reference solution (A) and samples (B)注:1-綠原酸;2-阿魏酸;3-歐前胡素;4-藁本內酯。Note:1-Chlorogenic acid;2-Ferulic acid;3-Imperatorin;4-Butenyl phthalide.

2.1.4 回歸線方程計算

移液管量取一定量“2.1.2”項下制備的標準品溶液,成比例稀釋并配制成6種不同質量濃度的混合標準品,加一定量色譜純甲醇定容并混勻,按“2.1.3”項下條件進樣10 μL。設橫坐標(X)表示質量濃度,縱坐標(Y)表示峰面積,計算綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、藁本內酯的線性回歸方程依次是Y=499 557X-1 299.7、Y=1.9×107X-6 009.5、Y=1.9×106X-9 909.2、Y=499 951X-6 029.3,表示上述四種化學成分在各自范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度考察

移液管量取一已知含量樣品溶液10 μL,連續6次按“2.1.3”項下條件進樣,統計阿魏酸等四種化學成分色譜峰面積,并計算其RSD依次是0.98%、0.97%、0.99%、0.95%,表示儀器精密度滿足試驗要求。

2.1.6 重復性考察

萬分之一電子天平平行稱取當歸尾藥材6份,按“2.1.1”項所述方法配制樣品溶液;并按“2.1.3”項下條件檢測阿魏酸等四種化學成分百分含量,并計算其RSD依次是0.92%、1.25%、0.71%、0.86%,表示此方法滿足試驗重復性要求。

2.1.7 穩定性考察

取一已知含量樣品溶液,按“2.1.3”項下條件,分別在0、2、4、8、12、24 h進樣,計算阿魏酸等四種化學成分對應的峰面積,并計算其RSD依次是0.93%、0.98%、1.19%、1.24%,表示樣品溶液在24 h內滿足試驗穩定性要求。

2.1.8 加樣回收率試驗

移液管移取已知含量的樣品溶液6份,每份2.5mL,并分別用移液管加入混合標準品溶液一定量。按“2.1.3”項下條件進樣測定;計算阿魏酸等四種化學成分的平均加樣回收率依次是99.92%、101.21%、99.96%、100.19%,RSD依次0.29%、0.17%、0.69%、0.81%。表示該含測方法滿足試驗準確度要求。

2.1.9 樣品含量測定

按“2.1.3”項下條件,對經正交提取的當歸尾9組樣品中阿魏酸等四種化學成分色譜峰面積進行測定,并算出各成分相應百分含量,依次記為Y1、Y2、Y3、Y4(見表2)。

表2 試驗設計及結果Table 2 Design and results

2.2 當歸尾藥材干膏率的測定

移液管量取“2.1.1”項下樣品溶液10 mL,放入干燥至最后兩次質量差小于0.3 mg的蒸發皿中,回收溶劑至干,105 ℃下加熱3 h,干燥器中靜置30 min,稱重、記數,記為YG(見表2)。

2.3 當歸尾提取工藝優化

參照預試驗結果,擬定當歸尾提取工藝優化正交試驗方案。以提取次數(A)、料液比(B)、提取時間(C)為考查因素,并各設3個水平,見表1;以阿魏酸等4種化學成分百分含量和當歸尾藥材干膏率為評價指標,安排L9(34)正交試驗(見表2);方差分析及相應結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.4 CRITIC法計算權重

將表2中的試驗數據經過線性插值處理,得指標成分標準化值=(實測值-最小值)/(最大值-最小值)×100。

運用MATLAB R2012a軟件對當歸尾中阿魏酸等4種化學成分含量及浸出物的正交試驗結果進行編程,并結合CRITIC法,參照公式(1)、(2)、(3)計算相應權重。

(1)

(2)

(3)

其中Rj代表j個指標含有的信息量,rij代表i和j兩指標相關系數;σj表示標準化后列向量的標準差。經CRITIC法計算,阿魏酸等四種化學成分百分含量和當歸尾藥材干膏率的客觀權重分別為0.288 9、0.217 7、0.145 5、0.157 3、0.190 6。綜合評分=(Y1/Y1max)×0.288 9+(Y2/Y2max)×0.217 7+(Y3/Y3max)×0.145 5+(Y4/Y4max)×0.157 3+(YG/YGmax)×0.190 6×100。結果見表2,即當歸尾的提取工藝為加入藥材重量的10倍量體積提取液,提取3次,每次提取90 min。

2.5 BP-ANN

2.5.1 模型構建

以BP-ANN 3層結構構建相應模型,設輸入節點數為上述三種考察因素,輸出節點數為綜合評分。

2.5.2 相關參數的網絡模擬訓練

借助MATLAB R2012a編程軟件,建立“2.5.1”中模型,經訓練得到3-10-1網絡模型,可擬合各因素水平與綜合評分間映射關系。賦值提取次數、料液比、提取時間,借助上述模型進行訓練,得相應均方差曲線見圖2,開展提取工藝相關參數優化,比較模擬值與測定值。數據證明,上述兩值相關系數r=0.998 64,即該模型滿足試驗要求。

圖2 訓練及結果Fig.2 Training and results

2.5.3 模擬結果

隨機選取并固定提取次數、料液比、提取時間中某兩因素水平值,其余因素水平值按一定比例增減,運用α=sim (net,β)(α為模擬值,β為上述因素各水平值組合)進行模擬測試,以找出當歸尾提取工藝相關參數的最優值。通過上述方法建立的當歸尾最優提取工藝為:加入當歸尾質量9.6倍體積娃哈哈純凈水,進行3次加熱回流提取,提取時間為67 min/次;上述提取工藝下所得最大綜合評分是98.36。

2.6 驗證試驗

萬分之一電子天平稱取當歸尾藥材,平行6份,各50 g,參照BP-ANN模型和正交試驗所得最優工藝參數開展試驗驗證,測定當歸尾中阿魏酸等4種化學成分百分含量和當歸尾藥材干膏率,并計算各自綜合評分,見表4;結果顯示,參照BP-ANN模型優化工藝開展的3批驗證試驗,其綜合評分結果均高于以正交試驗結果為參照開展的3批驗證試驗所得綜合評分結果,且前者綜合評分均值98.77也高于后者的98.17,表明采用BP-ANN模型優化的當歸尾提取工藝參數好于正交試驗。即提取工藝最優參數是加入當歸尾質量9.6倍體積娃哈哈純凈水,進行3次加熱回流提取,提取時間為67 min/次。

表4 驗證結果與比較Table 4 Verification results and comparison

3 討論與結論

3.1 考察指標的選擇

文獻研究表明,文中所涉阿魏酸、綠原酸及藁本內酯是目前當歸研究中出現頻次較多的化學成分;阿魏酸是《藥典》規定的當歸指標性成分,同時具有抗血小板聚集、抑制血小板5-羥色胺釋放等作用;綠原酸是當歸中重要的酚酸類成分,臨床研究表明其不僅可以興奮中樞神經系統,同時還能抗病毒、抗菌;藁本內酯作為當歸重要的揮發油類活性成分之一,能夠解痙、鎮靜、治哮喘;歐前胡素是當歸中重要的香豆素類成分,且因產區不同存在較大差異,但少有以其作為當歸指標成分的相關研究[8,9]。

綜上,并結合前期研究,本文以上述4種化學成分百分含量和當歸尾藥材干膏率為考察指標,可使本研究結果更科學、更精準,同時滿足中醫臨床用藥通道、靶點繁多,病程層次復雜等特點。

3.2 權重系數計算方法的選擇

眾所周知,中藥藥效成分復雜且藥理作用廣泛,對其進行多指標成分研究時常需明確各指標成分權重系數。CRITIC法是利用評價指標本身標準偏差和相關系數,以綜合衡量相關權重的客觀賦權方法,其所得權重系數受研究者知識、閱歷等諸多因素影響較少,其所得相關權重相較于主觀賦權、AHP賦權等賦權方法更具科學性和嚴謹性。

3.3 BP-ANN

BP-ANN是一種可模擬人腦組織結構和其運轉機制的智能系統,其不僅具有自組織、自適應、自學習能力,同時還有良好的函數逼近能力。BP-ANN可較好地進行擬合與預測,以便找出限定范圍內的最優值,較之正交試驗、響應面等試驗設計方法,其可經自主學習找出限定范圍內的最優提取工藝參數,在減少試驗次數的同時使所得條件更精準;同時符合中藥提取的復雜性與多元化性[10-13]。

綜上,本試驗運用BP-ANN結合CRITIC法優化當歸尾提取工藝參數,其結果更具科學性、嚴謹性、準確性;可為當歸尾后續的系統化、體系化研究提供數據支撐,為當歸的進一步深化研究提供新的思路。