基于UFLC-QTRAP-MS/MS技術分析三葉崖爬藤不同部位的多元活性成分

陳海杰,周永逸,薛 佳,鄒立思*,吳 楠,袁嘉歡,劉訓紅,2,程建明,2

1南京中醫藥大學藥學院;2江蘇省經典名方工程研究中心,南京 210023

三葉青為葡萄科崖爬藤屬三葉崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg(THDG)的塊根或全草[1,2],藥用歷史悠久,屬“新浙八味”之一,具有清熱解毒,活血祛風等功效,主要用于高熱驚厥,肺炎,哮喘,肝炎,風濕,瘰疬,跌打損傷[3]。現代藥理研究表明三葉青具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、解熱、鎮痛、免疫調節等藥理作用[4-6]。

三葉崖爬藤主要生長于長江以南地區[2],在浙江民間地區有較久的藥用歷史,其全草及塊根皆可使用,而近些年有研究發現其不同藥用部位在化學成分、藥理活性等方面,存在明顯的差異性,如地上部分提取物的抗氧化活性顯著高于地下部分提取物,而地下部分提取物的羥基自由基清除活性顯著高于地上部分[7]。由于三葉青目前只收錄于地方中藥標準規范[8],其指標成分并未明確規定,且隨著近些年研究表明除黃酮[9-10]、酚酸[11]、多酚[12]、多糖[13]等為三葉青主要的活性成分外,鞣質、氨基酸及核苷等成分也有潛在的生理活性。其中原花青素B2等鞣質成分具有抑制胃癌發生的作用[14],氨基酸類成分對肝損傷具有較好的療效[15],而核苷類成分具有良好的抗菌抗病毒作用[16]。目前,對于三葉崖爬藤不同部位活性成分的研究主要集中于總黃酮[17]、總酚酸[11]、總多糖[18],較少有同時對多種活性成分類別進行含量測定,且其不同部位質量評估與控制方面的分析方法主要是高效液相色譜法[19]、氣相色譜質譜聯用法[20]和液質聯用技術[21]等。因此為了給三葉崖爬藤不同部位的質量控制及資源合理應用提供參考數據,有必要建立一種快速測定其不同部位活性成分含量并進行質量評估的方法。

超快速高效液相色譜-三重四極線性離子阱質譜聯用技術(UFLC-QTRAP-MS/MS)具有高分離度、高選擇性、高靈敏度,能夠對混合化合物進行快速分離鑒別,適合于三葉青多組分復雜體系的分離分析。因此,本研究以三葉崖爬藤的塊根、莖、葉為實驗對象,通過UFLC-QTRAP-MS/MS技術同時測定60種活性成分,采用主成分分析法(PCA)、偏最小二乘回歸分析法(PLS-DA)、方差分析法等多元統計分析方法來區分和揭示不同部位之間的活性成分差異,并應用灰色關聯度分析法(GRA)對不同部位進行質量評估。本研究結果可為三葉崖爬藤不同藥用部位多種活性成分的快速定量及質量控制提供方法參考,并為其資源的合理開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸(批號:110831-200302)、槲皮苷(批號:111538-200302)、尿苷(批號:887-200202)、槲皮素(批號:100081-200406)、表兒茶素(批號:10878-200102)、山柰酚(批號:110861-200303)、蘇氨酸(批號:140682-201302)、絲氨酸(批號:140688-201803)、谷氨酸(批號:140690-201604)、纈氨酸(批號:140681-201703)、金絲桃苷(批號:111521-201406)、脯氨酸(批號:140677-201808)、腺苷(批號:110879-201703)、咖啡酸(批號:110885-201703)、異亮氨酸(批號:140683-201302)、鳥苷(批號:111977-201501)、亮氨酸(批號:140687-201905)、牡荊素(批號:111687-202105)、苯丙氨酸(批號:140676-201706)、異鼠李素(批號:110860-201611)購自中國食品藥品檢定研究院;次黃嘌呤(批號:1400661-hypoxanthine)、組氨酸(批號:O60M821V)、甘氨酸(批號:SM15GA14)、丙氨酸(批號:S20A6G17672)、天冬氨酸(批號:BCBG3906V)、胞苷(批號:100982718)、尿嘧啶(批號:TM0313XB13)、2′-脫氧腺苷(批號:XM0516GA14)、酪氨酸(批號:SM0503GE13)、2′-脫氧鳥苷(批號:N07A7W12580)、2′-脫氧肌苷(批號:WN1119 HB14)、肌苷(批號:TJ0623XA13)、原兒茶酸(批號:H21J9Z64031)、木犀草素(批號:C24M8Q36543)、胸苷(批號:1001182663)、兒茶素(批號:P21J11F 118380)、虎杖苷(批號:ZM0530LA14)、白藜蘆醇(批號:YM0509YA14)、芹菜素(批號:T30A11 F112008)購自上海源葉生物科技有限公司;原兒茶醛(批號:101204)購自上海融禾醫藥科技有限公司;蘆丁(批號:0080-9705)購自中國生物制品檢定所;異槲皮苷(批號:C21H20012)購自江蘇永健醫藥科技有限公司;葒草苷(批號:RDD-H04402 201005)、表沒食子兒茶素(批號:RDD-B0211 1812016)、異葒草苷(批號:RDD-Y13211903019)購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司;原花青素B2(批號:DSTDY005001)、原花青素B1(批號:DSTDY005101)、異牡荊素(批號:DSTDY005401)、紫云英苷(批號:DSTDZ000101)、煙花苷(批號:DST200619-075)購自成都德斯特生物技術有限公司;隱綠原酸(批號:12112605)、新綠原酸(批號:12112712)購自成都普瑞法科技開發有限公司;白皮杉醇(批號:AF21101758)、牡荊素鼠李糖苷(批號:AF20091006)、香橙素(批號:AF21052108)、水仙苷(批號:AF21061303)、阿福豆苷(批號:AF20121404)購自成都埃法生物科技有限公司;半胱氨酸(批號:20161127)、賴氨酸(批號:20161122)、綠原酸(批號:20160701)購自寶雞市辰光生物科技有限公司。以上化合物純度均大于98%。甲醇、乙腈、甲酸(均為色譜純)購自德國Merck公司;乙醇(分析純)購自南京化學試劑股份有限公司;實驗用水為 Milli-Q超純水。

三葉崖爬藤各部位樣品于2022年1月7日采自浙江省臺州市黃巖區(北緯32°3′52.74",東經118°48′8.71"),均為三年生,經南京中醫藥大學藥學院劉訓紅教授鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的塊根、莖、葉(見圖1)。憑證標本存放在南京中醫藥大學中藥鑒定實驗室,詳細信息見表1。

表1 三葉崖爬藤不同部位樣品信息Table 1 Sample information of different parts of THDG

圖1 三葉崖爬藤全株及不同部位Fig.1 Whole plant and different parts of THDG

1.2 儀器與設備

DHG-9410A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);KQ-500B超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司,超聲功率500 W,40 kHz);Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司);湘儀H1650-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);SIL-20A XR超快速液相色譜儀,包括LC-20AD二元輸液泵、CTO-20AC柱溫箱、STL-20A XR自動進樣器(日本島津公司);AB QTRAP 5500三重四極桿線性離子阱質譜儀,配有Analyst 1.6.3軟件和電噴霧離子源(美國AB SCIEX公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為XBridge?C18色譜柱(4.6 mm× 100 mm,3.5 μm);以水(含0.4%甲酸)流動相A,以甲醇為流動相B;梯度洗脫程序:0～4 min,7%→9% B;4～6 min,9%→21% B;6～10 min,21%→35% B;10～12 min,35%→38% B,12～16 min,38%→46% B;16～20 min,46%→64% B;20～21 min,64%→7% B;柱溫30 ℃;流速0.8 mL/min;進樣量2 μL。圖2為60種化合物的MRM圖,圖3為混合對照品的TIC圖,圖4為供試品的TIC圖。

圖2 60種成分的MRM圖Fig.2 Multi-reaction monitoring (MRM) of 60 constituents

圖3 混合對照品總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of the mixed control

圖4 供試品總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of the sample

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI);噴霧電壓(IS):離子源溫度(TEM):550 ℃;多反應監測離子掃描模式(MRM)檢測,各化合物去簇電壓(declustering potential,DP)及碰撞能量(collision energy,CE)見表2;正離子模式為4 500 V、負離子模式為-4 500 V;霧化氣(GS1):55 psi;氣簾氣(CUR):40 psi;輔助氣(GS2):55 psi;接口加熱,全程通入氮氣。各化合物的最佳質譜參數見表2。

表2 60種化合物的質譜參數Table 2 Mass spectrometric parameters of 60 constituents

1.3.3 對照品溶液制備

分別稱取賴氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、胞苷、尿嘧啶、纈氨酸、次黃嘌呤、尿苷、腺苷、2′-脫氧腺苷、酪氨酸、鳥苷、肌苷、沒食子酸、2′-脫氧鳥苷、異亮氨酸、2′-脫氧肌苷、亮氨酸、胸苷、原兒茶酸、苯丙氨酸、新綠原酸、原花青素B2、原兒茶醛、表沒食子兒茶素、兒茶素、原花青素B1、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、虎杖苷、葒草苷、異葒草苷、白皮杉醇、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素、金絲桃苷、香橙素、蘆丁、異槲皮苷、白藜蘆醇、槲皮苷、紫云英苷、煙花苷、水仙苷、阿福豆苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、異鼠李素對照品適量,精密稱定,置10 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液溶解制成質量濃度分別為1.008、1.000、1.160、1.180、1.100、1.180、1.160、0.960、1.024、1.046、0.962、1.010、1.010、0.998、1.064、0.784、0.970、1.000、0.990、1.104、0.970、1.016、1.070、1.078、1.012、1.014、1.164、1.036、0.960、1.096、1.154、1.034、1.044、1.075、0.984、0.662、1.052、1.034、1.062、1.034、1.168、0.996、1.118、1.056、0.994、0.936、0.970、1.020、1.094、1.036、1.032、1.004、0.992、0.982、0.866、1.032、1.128、0.320、1.064、1.062 mg/ml的對照品母液。分別取各對照品母液適量,置于10 mL容量瓶中,加60%乙醇定容,制成混合對照品溶液,逐級稀釋,得一系列不同濃度的混合對照品溶液,置5 ℃冰箱密封保存。

1.3.4 供試品溶液制備

精密稱定約0.5 g樣品粉末(過65目篩),置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇12.5 mL,密閉,稱定,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)50 min,放冷,用60%乙醇補足減失重,搖勻,濾過,濾液以12 000 r/min離心10 min,取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

1.3.5 方法學考察

1.3.5.1 標準曲線、檢測限和定量限

精密吸取“1.3.3”項下一系列濃度的對照品溶液及混合對照品溶液各2 μL,按“1.3.1”和“1.3.2”項色譜、質譜條件進樣分析。以對照品的質量濃度(X,ng/mL)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸獲得回歸方程、線性范圍和相關系數(r)。分別以信噪比S/N≈ 3和S/N≈ 10時各對照品的質量濃度作為檢測限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)。60種目標成分在一定質量濃度范圍內均呈良好的線性關系,r值均大于0.998 9,結果見表3。

表3 60種化合物的線性考察結果、檢測限及定量限Table 3 Linear test results,limits of detection,limits of quantification of 60 constituents

1.3.5.2 精密度、重復性、穩定性和加樣回收率試驗

精密吸取同一混合對照品溶液2 μL,在同一天內連續6次進樣分析,計算獲得60種目標成分峰面積的日內精密度相對標準偏差(RSD)為0.94%～4.98%;每天進樣3針,連續3天進樣分析,計算得日間精密度的RSD為0.89%～4.98%,表明儀器具有良好的精密度;取同一三葉青樣品6份,精密稱定每份為0.5 g,分別按“1.3.4”項方法制備供試品溶液,進樣分析,計算得60種目標成分含量的RSD為1.00%～4.98%,表明該方法具有較高的重復性;取同一三葉青供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h時進樣分析,計算得60種目標成分峰面積的RSD為0.81%～5.45%,穩定性考察結果如表4所示。精密稱定9份三葉青樣品粉末0.5 g,分別加入“1.3.3”中低、中、高3個水平(80%、100%、120%)的混合對照品溶液,每個水平3份。將供試品與對照品溶液置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇至12.5 mL,按“1.3.4”項方法制備加樣回收供試品溶液,并按“1.3.1”和“1.3.2”色譜及質譜條件進樣測定,計算各成分的平均回收率和RSD值。得到60種目標成分的平均回收率為96.1%～101.76%,RSD <4.87%,表明該方法的準確度良好,結果見表4。

表4 60種化合物的精密度、重復性、穩定性、加樣回收率Table 4 Precision,repeatability,stability,and recovery of 60 constituents

1.3.6 樣品含量測定

取供試品溶液注入液相色譜-質譜聯用儀,按照上述色譜-質譜條件測定,并做方法學考察,用外標法計算各樣品中目標成分的含量。

1.3.7 多元統計分析

根據60種目標成分的含量,用主成分分析、偏最小二乘判別分析、方差分析和灰色關聯度分析對三葉崖爬藤塊根、莖、葉進行分析與評價。使用Analyst 1.6.3工作站進行原始數據處理。將含量結果導入SIMCA-P 13.0進行分析,通過主成分分析初步觀察各樣品的聚集情況,再以偏最小二乘回歸分析法分別對各樣品進行分類,根據變量權重值(VIP >1)找到部分潛在的差異化學成分。運用SPSS Statistics 22.0進行單因素方差分析,篩選具有顯著性差異(P<0.05)的成分。灰色關聯度分析則由Excel表格進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

為了獲取最佳的色譜條件,比較XBridge?C18柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm)和Agilent ZORBAXSB-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)對60種活性成分的分離效果,前者分離度和靈敏度較高,故選擇XBridge?C18柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm)。分別考察了不同有機相(甲醇、乙腈)以及不同比例(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%)甲酸的水相,結果表明,當甲醇-0.4%甲酸水作流動相時,各成分能夠獲得較好的峰形,響應值較高,因此本實驗選用甲醇-0.4%甲酸水為流動相。

2.2 質譜條件的優化

為了獲得最佳的質譜條件,將60種活性成分在正離子和負離子模式下進行全掃描。結果顯示,氨基酸與核苷在正離子模式下有較高響應值,酚酸、鞣質和多酚化合物在負離子模式下響應更強。黃酮中除了葒草苷和異葒草苷在正離子模式下響應較高,其他成分在負離子模式下響應較佳。因此,本實驗同時選用正負離子兩種模式測定60種化合物的含量。

2.3 供試品制備方法的優化

以乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%、90%、100%)、提取時間(20、30、40、50、60 min)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)為考察因素,確定各因素適宜水平,以獲得最佳提取條件。結果表明,乙醇濃度、料液比和提取時間對提取物濃度影響較大。當乙醇濃度為60%,提取時間為50 min,料液比為1∶25進行超聲提取時,提取效果最好。

2.4 樣品含量結果

三葉崖爬藤不同部位六類活性成分含量測定結果見圖5、表5。從活性成分總含量角度分析,葉、莖、塊根分別達到了14 263、11 583、4 603 μg/g,表明不同部位中活性成分的積累規律為葉>莖>塊根。從各類成分的角度分析,圖5柱狀圖中的氨基酸、黃酮、酚酸、核苷四類成分在塊根、莖、葉中都呈低到高的趨勢,而鞣質、多酚化合物則在莖中含量最高。圖5餅圖中顯示,黃酮成分在不同部位中占比為葉>莖>塊根,表明三葉崖爬藤不同部位黃酮類成分的含量有明顯差異。此外,酚酸類成分在葉中占比達到了15.82%,顯著高于其他部位,而氨基酸在塊根與葉中占比均達到50%以上。綜上可表明不同部位間活性成分的積累有一定差異。

表5 三葉崖爬藤不同部位中六類成分含量Table 5 Content of six types of constituents in different parts of

圖5 三葉崖爬藤不同部位的六類成分含量柱狀圖與餅圖Fig.5 Histogram and pie chart of the content of six types of constituents in different parts of THDG

2.5 多元統計分析

2.5.1 主成分分析(PCA)

PCA分析可以將變量降維轉化為不相關的變量,對較多因素影響的數據分析能作出更合理的判斷。本實驗采用PCA對三葉崖爬藤不同部位樣品的數據進行分析(見圖6)。其中R2X = 0.966,Q2= 0.859表示模型成立可靠、預測率高。圖6顯示三葉崖爬藤不同部位在PCA模型中達到較好的分類效果,說明三者之間的多元活性成分存在差異。葉和塊根、莖距離較遠,說明葉和其他部位在多元活性成分上有明顯差異。

圖6 三葉崖爬藤不同部位的PCA分析Fig.6 PCA analysis of different parts of THDG

2.5.2 偏最小二乘回歸分析法與方差分析

為了進一步篩選對不同部位質量產生影響貢獻較大的成分,采用SMICA-P 13.0軟件分別對18批三葉崖爬藤不同部位的活性成分含量進行PLS-DA分析,圖7為PLS-DA分析與VIP得分圖,其中(R2X = 0.938,Q2= 0.982),表示模型成立可靠,預測性高。圖7顯示,三組樣品在PLS-DA模型中都達到良好的分類效果,樣品葉位于PC1軸左邊,而樣品塊根與莖位于PC1軸右邊,說明葉與其他兩組差異較大,塊根與莖在活性成分上具有一定相似性。通過VIP得分圖可分析對三組分類貢獻較大的成分(VIP >1),共篩選得到12個活性成分。

圖7 不同部位的PLS-DA分析與VIP得分圖Fig.7 Plot of PLS-DA analysis and VIP score for different parts注:VIP圖中橫坐標數字對應表2成分。Note:Horizontal numbers in the VIP diagram correspond to constituents in Table 2.

由于這12個化合物在不同部位中的具有一定的豐度變化,本研究運用SPSS Statistics 22.0對12個活性成分進行最小顯著性差異(LSD)檢驗(假設方差相等)或Tamhane′s T2檢驗(假設不存在方差相等)。如圖8,其中有8個成分在塊根、莖、葉三個部位中的含量存在顯著性差異。這些差異成分主要是黃酮類與氨基酸類,分別為牡荊素、異牡荊素、葒草苷、異葒草苷、原花青素B2、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸,這些化合物可作為區分三葉崖爬藤不同部位的活性成分標志物。

圖8 三葉青不同部位中12種化合物的方差分析Fig.8 Variance analysis of 12 compounds in different parts of THDG注:T、S、L分別代表塊根、莖、葉;*P <0.05;**P <0.01;***P <0.005。Note:T:Tubers,S:Stems,L:Leaves;*P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.005.

2.5.3 灰色關聯度分析

灰色關聯度分析(GRA)是灰色系統理論中的一種影響度量方法,它分析給定系統中一個主要因素和所有其他因素之間的不確定關系。根據60種生物活性成分的含量,對三葉崖爬藤不同部位進行GRA綜合評價。GRA結果包括灰色綜合評價值(相對關聯度,ri)和質量等級排序如表6所示。相對關聯度表示組分含量與樣品之間的相對關聯關系,ri值越高表示樣本質量越好。從表中排序來看,各部位樣品較為集中,葉(S7～S12)排序靠前,莖(S13～S18)和根(S1～S6)其次,說明葉部位的品質相對其他兩部位較優。此外,S10與S6的ri差異值達到了49%,也從側面表明三葉崖爬藤不同部位間品質差異較大。

表6 不同部位的灰色關聯度分析Table 6 Gray correlation analysis of different parts

3 討論與結論

研究結果表明,三葉崖爬藤塊根、莖、葉間質量差異明顯,部分成分的含量存在顯著性差異。通過PLS-DA、VIP值與方差分析篩選出8種化合物可作為區分不同部位的活性成分標志物,其中牡荊素、異牡荊素、葒草苷、異葒草苷在葉、莖、塊根中含量均呈高到低趨勢,且皆為黃酮碳苷類化合物。由于黃酮碳苷類成分有極強的DPPH自由基清除能力[22],因此本實驗結果也可為三葉崖爬藤地上部分抗氧化活性高于地下部分的結論提供數據依據[7]。此外,原花青素B2在莖中含量高達5 029.22 μg/g,與塊根、葉分別相差4倍、15倍之多,且其具有明顯的抗氧化、抗腫瘤等活性,表明原花青素類成分可能在不同部位的代謝活動中起到重要的作用。灰色關聯度分析中相對關聯度(ri)值可對塊根、莖、葉樣品進行質量等級排序,而最終結果顯示葉部位樣品(S7～S12)排序靠前,表明其質量優于莖與塊根部位。

綜上所述,本研究建立了超快速高效液相色譜-三重四極線性離子阱質譜聯用技術(UFLC-QTRAP-MS/MS)同時測定三葉崖爬藤不同部位中的60種活性成分的方法,并結合多元統計分析對不同部位進行比較和評價。含量測定結果表明各部位活性成分種類豐富,其中葉部位中的多元活性成分總含量高于莖與塊根。此外,主成分分析等多元統計分析表明三葉崖爬藤不同部位活性成分差異明顯,并揭示了8種顯著性差異成分,分別為牡荊素、異牡荊素、葒草苷、異葒草苷、原花青素B2、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸。灰色關聯度分析表明葉部位的品質相對較優,莖與塊根其次。本研究結果為三葉崖爬藤不同部位活性成分的測定及質量控制提供了方法參考,并為其資源的合理開發利用奠定基礎。