基于GC-MS指紋圖譜和網絡藥理學的白術揮發性成分質量標志物預測分析

吳姣姣,劉 東,張 莉,夏 佳,楊 雨,唐 飛,陳 璐,敖 慧

成都中醫藥大學藥學院,成都 611137

中藥材普遍存在多基原、多產地等復雜情況,質量差異較大,亟待建立科學合理的中藥質量保障體系。目前多數中藥材質量控制指標選擇多為其含有的化學成分,但其與藥物功效關聯不足[1]。基于此,劉昌孝院士提出用“中藥質量標志物”的概念[2]。中藥質量標志物是與中藥的功能屬性密切相關的化學物質,反映了中藥質量控制的發展方向[1-3]。故研究中藥質量標志物是提升我國中藥質量控制水平,為臨床提供安全有效中藥產品的重要手段。

白術是常用大宗中藥材,具有健脾燥濕、利水止汗等功效,廣泛應用于中醫臨床。然而,目前白術并沒有業內公認的質量標志物[4],這將影響白術的質量提升和進一步開發利用。現有研究表明揮發油和多糖是白術的主要有效成分[5,6]。多糖由于結構特殊,目前很難作為質量標志物或質量控制成分[7]。研究表明白術揮發油具有調節胃腸道、修復胃黏膜、抑菌、保肝等藥理作用,與白術藥理作用基本類似[8,9],并且可用GC-MS等技術實現定性定量檢測[10]。故從白術揮發油中篩選白術質量標志物是可行有效的思路。但白術揮發油受產地、土壤、氣候、采收等因素影響,化學成分種類差異較大[10,11],因此有必要建立白術揮發油GC-MS指紋圖譜尋找其共有化學特征,初步確定候選質量標志物。網絡藥理學具有系統性和整體性的特點,是一種建立在系統生物學和網絡生物學基礎上的新興研究方法,已被廣泛應用于單味藥及復方藥治療疾病的物質基礎和多靶點作用機制預測[12]。將指紋圖譜與網絡藥理學相結合尋找中藥質量標志物的方法已成功應用于江枳殼、連翹、白花蛇舌草、山銀花等中藥的質量標志物預測[12-17],但尚未見GC-MS指紋圖譜和網絡藥理學相結合的方法應用于白術揮發油質量標志物預測分析。因此,本研究采用GC-MS對白術揮發油成分進行分析和指紋圖譜建立,并結合利用網絡藥理學方法對白術揮發油成分、靶點、通路進行系統性分析,并預測白術揮發油的潛在質量標志物,旨在為全面控制和評價白術片質量提供科學依據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥材

本研究11批白術藥材(編號S1～S11)均購于成都國際商貿城荷花池中藥材市場,經成都中醫藥大學陳璐副教授鑒定為菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖,樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.1.2 試劑

正己烷(分析純,成都市科隆化學品有限公司,批號:2017112401);無水硫酸鈉(分析純,成都市科隆化學品有限公司,批號:2020033101);水為蒸餾水。

1.1.3 儀器

輕油提取器(四川蜀牛玻璃儀器有限公司);Agilent氣相色譜-質譜聯用儀、Agilent GC-MSD工作站(7890A-5975C,美國安捷倫公司);Sartorius電子天平(BP211D AG,德國賽多利斯公司);高速中藥粉碎機(HX-200型,浙江省永康市溪岸五金藥具廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 白術揮發油提取

采用水蒸氣蒸餾法提取白術揮發油,稱取白術粗粉80 g,裝入1 000 mL圓底燒瓶,加入8倍量水浸泡3 h,電熱套加熱至微沸,回流提取6 h;經無水硫酸鈉脫水后,收集揮發油于已稱重的EP管中,再次稱重,密封后置于4 ℃冰箱保存。按公式(1)計算揮發油含量。

揮發油提取率=

揮發油質量(g)/藥材質量(g)×100%

(1)

1.2.2 供試品溶液制備

取揮發油30 μL溶于1 mL正己烷中,微孔濾膜過濾,濾液裝入進樣瓶,為GC-MS測定樣品。

1.2.3 GC-MS條件

色譜條件:色譜柱為Agilent 19091S-433色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm);載氣為氦氣(He),載氣速度1 mL/min;采取程序升溫,初始柱溫60 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升至160 ℃,保持5 min,再以4 ℃/min升至200 ℃,保持8 min,然后以6 ℃/min升至250 ℃,保持10 min;分流進樣,分流比為20∶1;進樣量:1 μL;溶劑延遲:3 min。

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源,電子能量為70 eV,離子源溫度:230 ℃,四級桿溫度:150 ℃,數據采集掃描模式為全掃描。

1.2.4 定性定量方法

各色譜峰對應的質譜圖經聯用儀的計算機譜庫檢索進行定性,質譜數據為NIST14.0譜庫。各組分的相對含量是根據總離子流圖由計算機采用峰面積歸一化法計算獲得。

2 白術揮發油的GC-MS分析結果

2.1 白術揮發油得率

樣品S1～S11揮發油得量及提取率見表2。

表2 11批白術藥材揮發油提取率Table 2 Extraction rate of 11 batches of AMO

2.2 GC-MS指紋圖譜建立

取11批白術揮發油,按“1.2.2”項下條件制備供試品溶液,按“1.2.3”項下GC-MS條件依次進樣,并記錄色譜峰面積,11批白術揮發油指紋圖譜見圖1。

圖1 11批白術揮發油指紋圖譜和共有峰標記Fig.1 The fingerprints and common peak markers of 11 batches of AMO

2.3 指紋圖譜共有峰標記及相似度評價

將11批白術揮發油總離子流圖導入中藥指紋圖譜相似度評價系統,以S8為參照圖譜,采用平均數法,時間寬度設為0.1 min,確定了10個共有峰,峰序及所對應的化合物見圖1和表2。以共有成分的色譜峰為參照進行多點校正,對11批白術揮發油整體相似度進行評價,結果顯示11批白術樣品相似度均大于0.992,表明11批白術樣品揮發油相似度較高,質量較為穩定,但各樣品揮發油中同一色譜峰的峰面積不同,說明所含成分的含量存在一定差異,如浙江產白術的揮發油中蒼術酮整體含量高于其他產區,欖香醇含量整體低于其他產區,詳見表3、表4。

表3 11批白術揮發油共有成分信息及相對含量Table 3 Common components and relative content of 11 batches of AMO

表4 11批白術揮發油GC-MS指紋圖譜相似度評價Table 4 Similarity of GC-MS fingerprints of 11 batches of AMO

2.4 主成分分析

采用帕諾米克分析平臺(http://v2.biodeep.cn/)對11批白術揮發油GC-MS共有成分含量信息[16,17]進行PCA主成分分析,相應得分結果見圖2。由PCA分析可見,批次S2、S4、S10分布于第一象限,S1、S3、S9分布于第二象限,S11在第三象限,S5～S8浙江產白術揮發油主要分布在第四象限。

圖2 11批白術揮發油PCA得分圖Fig.2 PCA score of the 11 batches of AMO注:A:安徽;C:四川;J:江西;Y:云南;Z:浙江,下同。Note:A:Anhui;C:Sichuan;J:Jiangxi;Y:Yunnan;Z:Zhejiang,the same below.

2.5 聚類分析

采用帕諾米克分析平臺(http://v2.biodeep.cn/)對11批白術樣品揮發油中共有成分含量[16,17]進行系統聚類分析,聚類結果見圖3。由聚類分析可見當分類距離為15時,樣品被分為2類,S4、S5～S8及S10為第一類,S1～S3、S9、S11為第二類。

圖3 11批白術揮發油聚類分析結果Fig.3 Cluster analysis results of the 11 batches of AMO

3 Q-Marker成分-靶點-通路網絡藥理學分析

3.1 Q-Marker候選成分選擇

根據GC-MS指紋圖譜確定的10個共有成分,采用峰面積歸一化法計算得到共有成分分別占S1～S11批次白術樣品揮發油總量的90.42%、90.2%、90.21%、87.96%、95.75%、92.02%、91.09%、89.26%、85.99%、87.93%、92.97%。表明這10個共有成分在白術揮發油中的代表性較強[15-18],可作為白術揮發油Q-Marker的候選成分。

3.2 成分靶點預測

利用Pub Chem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數據庫對白術揮發油10個Q-Marker候選成分進行化合物結構搜索和靶點信息搜集,Swiss Target Prediction數據庫中取Probability大于0的靶點。除24-noroleana-3,12-diene無符合條件靶點外,共搜集了9個白術揮發油成分靶點,除去重復靶點后使用uniprot轉化為基因名,得到173個相關靶點。

3.3 PPI網絡分析

將獲得的173個相關靶點導入STRING11.5(https://cn.string-db.org/)數據庫中,選擇“Homo sapiens”物種,去除單一節點,導出結果為.tsv格式,并將建立的蛋白相互作用關系導入 Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化分析,得到蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網絡,結果見圖4(圖中degree 值越大,節點越大,顏色越深);選取網絡中degree值大于2倍中位數的靶點作為關鍵靶點[16,17],結果共獲得19個關鍵靶點,結果見表5。

圖4 靶點PPI網絡圖 Fig.4 Target PPI network diagram

表5 關鍵靶點篩選結果Table 5 Key target screening results

3.4 GO與KEGG通路富集分析

利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對獲得的173個靶點進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析。選擇“Homo sapiens”物種下的“Gene_Ontology”進行富集分析,根據P<0.05對富集結果進行篩選,得到397個生物過程(biological process,BP)條目,55個細胞組成(cellular component,CC)條目,和116個分子功能(molecular function,MF)條目,按P值從小到大選取排名前20的條目,得到圖5。如圖5所示,BP主要與藥物反應、G蛋白偶聯受體、突觸傳遞、激素信號傳導、脂質代謝等有關;CC主要涉及細胞質、細胞膜、內質網膜組成、染色質等;MF主要與RNA轉錄因子活性、轉錄因子結合、鋅離子結合、DNA結合、G蛋白偶聯受體活性、氧化還原酶活性等相關。

圖5 GO功能富集分析結果Fig.5 GO function enrichment analysis results

利用DAVID數據庫進行KEGG_PATHWAY富集分析,并根據P<0.05,篩選得到KEGG信號通路66條,按P值從小到大選取排名前20的通路繪制得到圖6。圖6表明白術揮發油主要通過神經活性配體-受體相互作用、代謝途徑、化學致癌-受體激活、血清素能突觸、氮代謝、PPAR信號通路、花生四烯酸代謝、類固醇激素生物合成、鈣信號通路、膽汁分泌、膽堿能突觸等發揮作用。

圖6 KEGG通路富集結果Fig.6 Enrichment results of KEGG pathway

3.5 “成分-靶點-通路”網絡構建和Q-Marker預測分析

將9個搜集到靶點的白術Q-Marker候選成分、19個degree值大于2倍中位數[16,17]的關鍵靶點和20條通路導入Cytoscape 3.9.1軟件中構建“白術揮發油 Q-Marker候選“成分-靶點-通路”網絡,詳見圖7(圖中三角形節點代表活性成分,菱形節點代表關鍵靶點,方形節點代表通路,節點大小代degree值大小)。

圖7 “成分-靶點-通路”網絡圖 Fig.7 "Composition-target-pathway" network diagram 注:BZ1:纈草醇;BZ2:(-)-異喇叭烯;BZ3:γ-欖香烯;BZ4:β-桉葉醇;BZ5:棕櫚酸;BZ6:反式戊烯醇醋酸酯;BZ7:欖香醇;BZ8:蒼術酮;BZ9:4-環己基苯乙酮。Note:BZ1:Valerenol;BZ2:(-)-Isotrumpetene;BZ3:γ- Elemene;BZ4:β-Eucalyptol;BZ5:Palmitic acid;BZ6:trans-Valerenyl acetate;BZ7:Elemental alcohol;BZ8:Atractylone;BZ9:4-Cyclohexylacetophenone.

以化合物、靶點蛋白、信號通路之間的連接度degree值為參考(圖中degree 值越大,節點越大,顏色越深),發現棕櫚酸、β-桉葉醇、γ-欖香烯、欖香醇和蒼術酮等成分的連接度相對較高,提示這些成分可能是白術揮發油中發揮藥效的主要活性物質;靶點MAPK1、PTGS2、RXRA、CYP19A1、PPARA、NOS3、TNF、CYP2C19的連接度較高,可能是白術揮發油發揮作用的關鍵靶點;代謝途徑(Metabolic pathways)、化學致癌-受體激活(chemical carcinogenesis-receptor activation)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、血清素能突觸(serotonergic synapse)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)的連接度較大,提示這些通路可能是白術揮發油發揮作用的關鍵信號通路。

4 討論與結論

本研究通過GC-MS的方法建立了11批次不同產地白術揮發油類成分的指紋圖譜,并指認了10個共有峰,共有成分的總含量均占揮發油總量的85%以上。共有成分PCA分析結果顯示浙江產白術揮發油與安徽產白術揮發油有明顯區分,浙江白術分布更集中;聚類分析顯示當分類距離為15時,4批浙江白術可被聚為一類,這表明與安徽白術相比,浙江白術揮發油類化學成分含量更為相似穩定,而四川、云南、江西產區白術由于批次單一,暫無法確定其整體分布以及與浙江、安徽白術的差異。

此外,本研究以11批白術飲片揮發油共有成分為出發點,結合網絡藥理學的分析方法,構建白術揮發油“成分-靶點-通路”作用網絡,預測白術揮發油的主要作用通路及靶點。網絡藥理學結果顯示棕櫚酸、β-桉葉醇、γ-欖香烯、欖香醇和蒼術酮可能是白術揮發油的潛在質量標志物。白術揮發油具有調節胃腸道、修復胃黏膜、抑菌、保肝等作用[8,9]。現代研究表明棕櫚酸、β-桉葉醇、γ-欖香烯、欖香醇和蒼術酮等成分具有抗菌[17,18]、鎮靜鎮痛[19]、調節胃腸運動[20,21]、降壓[22]、保肝抗炎[23]、抗病毒[24]、抗感染[25]等藥理作用,與白術揮發油具有相似之處,故這些成分可能是白術揮發油發揮藥理作用的主要物質基礎,與中藥的功能屬性密切相關。“成分-靶點-通路”網絡構建結果顯示,MAPK1、PTGS2、RXRA、CYP19A1、PPARA、NOS3、TNF、CYP2C19和代謝途徑、化學致癌-受體激活、PPAR信號通路、血清素能突觸和雌激素信號通路則可能是白術揮發油發揮作用的關鍵靶點和信號通路。

綜上所述,我們的研究發現不同產地的白術飲片揮發油類成分的組成以蒼術酮、(-)-異喇叭烯、γ-欖香烯、β-桉葉醇、 棕櫚酸、trans-valerenyl acetate、欖香醇、4-cyclohexylacetophenone等為主,但含量有所不同。GC-MS指紋圖譜結合網絡藥理學確定棕櫚酸、β-桉葉醇、γ-欖香烯、欖香醇和蒼術酮可能是白術揮發油的潛在質量標志物。本研究進一步完善了白術的質量控制體系,為白術的質量控制提供理論依據,也為其他類似中藥材的質量標志物研究提供了理論參考。