LC-MS/MS同時(shí)測定22種膽汁酸在孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤中的應(yīng)用

趙 凡,張 倫,葉 露,張佳怡,余 蕓,黃倩倩,王建青

膽汁酸由膽固醇在肝細(xì)胞中代謝而來,是膽汁的主要脂質(zhì)成分,膽汁酸在生物體內(nèi)能夠乳化脂肪、促進(jìn)脂肪和膽固醇的吸收[1-2]。肝臟中主要合成的初級膽汁酸包括人的膽酸(cholic acid,CA)和鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)以及嚙齒動(dòng)物的α-鼠膽酸(α-muricholic acid,α-MCA)和β-鼠膽酸(β-muricholic acid,β-MCA),其中CA與CDCA進(jìn)入腸道后,在腸道菌群的作用下形成去氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)和石膽酸(lithocholic acid,LCA)等次級膽汁酸[3-4]。 以上游離的膽汁酸可以與甘氨酸和牛磺酸結(jié)合形成相應(yīng)的結(jié)合型膽汁酸。其中大部分膽汁酸通過肝腸循環(huán)途徑在回腸末端重吸收返回肝臟,剩余少量膽汁酸進(jìn)入全身循環(huán)和隨糞便排除[4]。

膽汁酸在細(xì)胞中過度積累會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,肝細(xì)胞中膽汁酸的累積最終將導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[5]。不同膽汁酸的生理功能差異較大,有研究[6]報(bào)道,LCA的毒性相對較大。測定孕鼠妊娠期體內(nèi)膽汁酸含量變化,了解妊娠期孕鼠體內(nèi)膽汁酸的分布情況,運(yùn)用于妊娠期間孕婦體內(nèi)膽汁酸紊亂相關(guān)疾病的預(yù)防具有重要意義。該實(shí)驗(yàn)建立LC-MS/MS檢測孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤樣本中的膽汁酸譜的方法,以期為后續(xù)生物樣本測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 癌癥研究所(institute of cancer research,ICR)小鼠(8周齡SPF級,雄性36～38 g,20只;雌性27～29 g,40只)購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0001。在適宜環(huán)境(溫度20～25 ℃,濕度50%±5%)飼養(yǎng)7 d。本研究所使用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)(編號:20200523)。

1.1.2儀器 AB Sciex Triple Quad 4500型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(購自美國AB公司);1200系列高效液相色譜儀(購自美國Agilent公司);Analyst1.4.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、1524R高速冷凍離心機(jī)和6K低速離心機(jī)(購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器公司);電子天平(型號:XS105DU,購自上海MettlerToledo公司);超純水儀(型號:Synergy,購自美國Milli-pore公司);渦旋振蕩器(購自美國VortexCenie公司);Bioprep-24R生物樣品均質(zhì)機(jī)(購自杭州奧盛儀器有限公司)。

1.1.3藥品與試劑 CA(純度 ≥ 98%,批號:SLCC7722)、LCA(純度 ≥ 95%,批號:BCBW1723)、CDCA(純度≥ 97% ,批號:MKBS2816V)、牛磺脫氧膽酸(taurodeoxycholate acid,TDCA,純度 ≥ 95%,批號:SLBX3488)、牛磺膽酸(taurocholic acid,TCA,純度≥ 95%,批號:SLCM1787)、甘氨鵝去氧膽酸(glycine chenodeoxycholic acid,GCDCA,純度 ≥ 97%,批號:SLCD4748)、甘氨熊去氧膽酸(glycine ursodeoxycholic acid,GUDCA,純度 ≥ 96% ,批號:BCBS9852V) 、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA,純度 ≥ 99% ,批號:SLBT3485) 、甘氨膽酸(glycocholic acid,GCA,純度 ≥ 97% ,批號:SLBR1284V)、牛磺熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA,純度 ≥ 98%,批號:13190318)、牛磺鵝去氧膽酸(taurochenodesoxycholic acid,TCDCA,純度 ≥ 98%,批號:SLCJ5790)和甘氨去氧膽酸(glycine deoxycholic acid,GDCA,純度 ≥ 97%,批號:BCCG0654),以上藥品購自美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。牛磺豬去氧膽酸(taurine hyodeoxycholic acid,THDCA,純度 ≥ 98%,批號:B16A10K94146)、豬去氧膽酸(hyodeoxycholic acid,HDCA,純度 ≥ 98%,批號:J24GB152684)、牛磺石膽酸(taurine cholic acid,TLCA,純度 ≥ 97%,批號:D11GS171051)、甘氨豬去氧膽酸(glycine hyodeoxycholic acid,GHDCA,純度 ≥ 98%,批號:Y23N9K75826)、甘氨石膽酸(glycine cholic acid,GLCA,純度 ≥ 98%,批號:B29J11K119775)、DCA(純度 ≥ 98.5%,批號:BCCG6672)、α-MCA(純度 ≥ 95%,批號:J14HS178006)和去氫膽酸(dehydrocholic acid,DHCA,純度 ≥ 98.5%,批號:S30J9I64022),以上藥品購自上海源葉生物科技有限公司。牛磺-β-鼠膽酸(taurine-β-muricholic acid,T-β-MCA,純度 ≥ 98%,批號:700244P-1MG-D-010)、β-鼠膽酸(β-MCA,純度 ≥ 98%,批號:700233P-1MG-C-010)和牛磺-α-鼠膽酸(taurine-α-muricholic acid,T-α-MCA,純度 ≥ 98%,批號:700243P-1MG-B-010),以上藥品購自美國Avanti? Polar Lipids公司。200目粉末狀活性炭、高效液相色譜級水、乙醇、冰乙酸、甲醇和乙酸銨,均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物處理 小鼠在適宜環(huán)境中飼養(yǎng)7 d,第8天21時(shí)將該批小鼠按照2只雄性和4只雌性小鼠的比例進(jìn)行合籠,次日7時(shí)檢查陰道栓,共20只雌鼠檢查出陰道栓。將有陰道栓的雌性小鼠定為妊娠第0天[(gestational day,GD)0],從中隨機(jī)抽取7只孕鼠,飼養(yǎng)至GD16進(jìn)行剖殺,收集母血、母肝、羊水和胎盤。

1.2.2色譜條件 色譜柱:Phenomenex Gemini 3 μm NX-C18 110A (100 mm × 2.0 mm);流動(dòng)相:A相為含有0.1%冰乙酸的4 mmol/L乙酸銨溶液,B相為甲醇;柱溫為40 ℃;流速為0.4 ml/min;進(jìn)樣量為10 μl。梯度洗脫程序見表1。

表1 樣品分析的洗脫條件

1.2.3質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,負(fù)離子檢測,掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM),電噴霧電壓:4 200 V;碰撞氣:4 psi;氣簾氣:30 psi;霧化氣:50 psi;輔助氣:50 psi;離子源溫度:500 ℃。22種膽汁酸及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見表2。

表2 22種膽汁酸及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

1.3 樣品前處理

1.3.1血清和羊水的處理 血清和羊水各吸取50 μl,加入250 μl甲醇和200 ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液50 μl 后,渦旋混勻1 min,于-20 ℃放置20 min,在4 ℃低溫離心機(jī)中以10 200 r/min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中,氮?dú)獯蹈?用50 μl 甲醇:水溶液(1 ∶1,V/V)溶解干燥沉淀,在4 ℃低溫離心機(jī)中以10 200 r/min,取上清液進(jìn)行分析。

1.3.2肝臟和胎盤的處理 取肝臟和胎盤組織各100 mg,加入裝有1 ml 75%乙醇的1.5 ml離心管內(nèi),隨后進(jìn)行組織勻漿,先置于50 ℃水浴2 h后,在4 ℃低溫離心機(jī)中以7 900 r/min,取上清液50 μl 置于1.5 ml離心管中,加入200 ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液50 μl ,渦旋混勻1 min,在4 ℃低溫離心機(jī)中以10 200 r/min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中,氮?dú)獯蹈?用50 μl 甲醇:水溶液(1 ∶1,V/V)溶解干燥沉淀,在4 ℃低溫離心機(jī)中以10 200 r/min,取上清液進(jìn)行分析。

1.3.3空白基質(zhì)的制備 分別取孕鼠血清、羊水、肝臟和胎盤的勻漿液,配制成活性炭濃度0.1 g/ml勻漿混懸液,震蕩渦旋1 h,在4 ℃低溫離心機(jī)中以11 600 r/min,取上清液備用。

1.3.4膽汁酸儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)溶液及系列工作液的配制 分別取22種膽汁酸組分標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg,精密稱定,在10 ml容量瓶中用50%甲醇水溶液定容至10 ml,得到1 mg/ml的各膽汁酸溶液。隨后將22種膽汁酸組分混勻后定容至10 ml,得到各膽汁酸濃度為10 000 ng/ml的膽汁酸儲(chǔ)備液,最終將膽汁酸儲(chǔ)備液用空白基質(zhì)稀釋成2.5、5、10、25、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 ng/ml的混合對照品曲線系列工作液,冷藏保存。

取內(nèi)標(biāo)對照品約10 mg,精密稱定,用50%甲醇水溶液定容至10 ml,充分混勻得到濃度為1 mg/ml的內(nèi)標(biāo)混合液,隨后用50%甲醇水溶液稀釋成200 ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作液,冷藏備用。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1專屬性 孕鼠空白基質(zhì)、孕鼠空白基質(zhì)加入膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)對照品工作液的色譜圖分別見圖1。

圖1 22種膽汁酸和內(nèi)標(biāo)LC-MS/MS色譜圖A:空白基質(zhì);B:空白基質(zhì)加膽汁酸混標(biāo)及內(nèi)標(biāo)品;C:膽汁酸混標(biāo)色譜圖;1:α-MCA;2:β-MCA;3:CA;4:UDCA;5:THDCA;6:CDCA;7:DCA;8:DHCA;9:GCA;10:GUDCA;11:GHDCA;12:GCDCA;13:GDCA;14:GLCA;15:LCA;16:T-α-MCA;17:T-β-MCA;18:TCA;19:TUDCA;20:HDCA;21:TCDCA;22:TDCA;23:TLCA

表3 22種膽汁酸線性范圍、回歸方程以及相關(guān)系數(shù)

2.1.3準(zhǔn)確度與精密度 取膽汁酸混合儲(chǔ)備液制備10、50、500 ng/ml 3種濃度的質(zhì)控樣品,每種濃度平行5份,連續(xù)進(jìn)樣3 d,計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度,結(jié)果見表4。血清樣本中各膽汁酸的準(zhǔn)確度在89%～106%,日間和日內(nèi)精密度RSD在0.5%～7.4%,結(jié)果符合要求。

表4 血漿質(zhì)控樣品中各膽汁酸的準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)以及提取回收率

2.1.4基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率 配制3種標(biāo)準(zhǔn)樣品(A1、A2、A3),每種樣品配制3個(gè)濃度(10、50、500 ng/ml)。A1是使用50%甲醇配制不含基質(zhì)的混合對照品溶液;A2是使用空白基質(zhì)氮吹干燥后,使用50%甲醇復(fù)溶配制的混合對照品溶液;A3是按照1.2.2項(xiàng)下處理的空白基質(zhì)配制混合對照品溶液。分別進(jìn)樣,記錄各膽汁酸和內(nèi)標(biāo)峰面積。A2/A1為質(zhì)控濃度的基質(zhì)效應(yīng),A3/A2為質(zhì)控濃度的提取回收率,基質(zhì)效應(yīng)準(zhǔn)確度在88%～110%,RSD在0.5%～15%,提取回收率在84%～108%,RSD在1%～15%,均符合要求,結(jié)果見表4。

2.1.5穩(wěn)定性 配制樣品基質(zhì)低、中、高3種質(zhì)控濃度樣品,每個(gè)質(zhì)控濃度樣品平行制備5份,考察放置于自動(dòng)進(jìn)樣器24 h、室溫放置6 h后,-80 ℃反復(fù)凍融3次及-80 ℃冰箱中冷凍保存90 d后的穩(wěn)定性,結(jié)果均穩(wěn)定。

2.2 孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤的膽汁酸含量測定通過建立的LC-MS/MS方法測定7只孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤的膽汁酸成分。見表5,在母鼠血清膽汁酸成分含量較高的是CA、TCA和β-MCA;肝臟中膽汁酸成分含量較高的是TCA、T-β-MCA; 羊水膽汁酸成分含量較高的是TCA;胎盤中膽汁酸成分含量較高的是TCA。由于不同部位膽汁酸成分含量不同,部分膽汁酸低于儀器檢測限而未能檢測出來。

3 討論

膽汁酸是人體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性物質(zhì),而且其理化性質(zhì)差異較大,存在多種同分異構(gòu)體[7]。為了使各膽汁酸成分能夠在短時(shí)間內(nèi)有效分離,本研究經(jīng)過多次重復(fù)性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相A相中以含有0.1% 冰乙酸的4 mmol/L乙酸銨水溶液分離效果最理想。國內(nèi)關(guān)于孕鼠體內(nèi)生物樣本中膽汁酸成分的測定方法學(xué)未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要使用蛋白沉淀法作為孕鼠血清和羊水的前處理方法,該方法簡單快捷[8],對于孕鼠肝臟和胎盤,使用恒溫水浴孵育的方法提取膽汁酸進(jìn)行前處理[9]。對取得處理好的上清液,進(jìn)行氮吹干燥后復(fù)溶上機(jī)檢測,能夠得到很好的檢測效果。

本研究測定了孕鼠血清、肝臟、羊水和胎盤的22種膽汁酸成分,包含游離型和結(jié)合型在內(nèi)的初級和次級膽汁酸。檢測的結(jié)果表明,在孕鼠血清中,游離型膽汁酸含量最高的是CA,占比為29.43%,結(jié)合型膽汁酸含量最高為TCA,占比為20.16%。而在孕鼠肝臟、羊水、胎盤中含量最高的均為TCA,且占比均超過50%,并且發(fā)現(xiàn)胎盤中可檢測的膽汁酸成分最少。在人體中,含量最高的初級膽汁酸有CA和CDCA,以及次級膽汁酸DCA、LCA和UDCA[10-11]。

臨床上對于妊娠期肝病多以血清總膽汁酸水平含量作為診斷指標(biāo)[12]。血清總膽汁酸對于妊娠期肝病的診斷特異性較差,這可能會(huì)給臨床明確診斷妊娠期肝病帶來一定難度,無法早期準(zhǔn)確識別妊娠期肝病且易產(chǎn)生混淆和誤診,甚至?xí)?dǎo)致不良的圍產(chǎn)期結(jié)局,包括不必要的醫(yī)源性早產(chǎn)、剖宮產(chǎn)和意外的宮內(nèi)胎兒死亡[13]。因此,依靠總膽汁酸對妊娠期肝病進(jìn)行診斷和鑒別診斷具有明顯的局限性,該研究使用孕鼠作為實(shí)驗(yàn)對象,模擬孕婦妊娠期,建立LC-MS/MS檢測膽汁酸譜的方法學(xué)有利于妊娠期肝病診斷和治療,具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。