低氧/冷暴露對(duì)肥胖大鼠模型白色脂肪棕色化的影響

郜 琨,楊歷新,王 葉,許海琦

目前,肥胖是影響人類健康的重大問題,其成為了危害身體健康的頭號(hào)殺手[1]。肥胖已經(jīng)取代了營養(yǎng)不良和感染的疾病影響,與一些疾病如糖尿病[2]都有明顯的相關(guān)關(guān)系。如何減控體質(zhì)量已成為目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。低氧環(huán)境下的體質(zhì)量減輕是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的生理現(xiàn)象,國內(nèi)外有包括長期慢性低氧和短期低氧暴露情況下關(guān)于體質(zhì)量的各種觀察研究。研究[3]表明,冷暴露不僅能提高棕色脂肪活性,還能高度選擇性地刺激皮下脂肪解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP-1)的表達(dá)和產(chǎn)熱活性。還有研究[4]指出,低氧暴露可以降低體脂,冷暴露可誘導(dǎo)白色脂肪棕色化和棕色脂肪組織分化,但有關(guān)低氧、冷暴露后白色脂肪棕色化的生物學(xué)機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過白色脂肪棕色化對(duì)傳統(tǒng)調(diào)控機(jī)制PPAR-γ2、PRDM16和UCP-1表達(dá)和活性的增強(qiáng)效應(yīng),探究低氧/冷暴露對(duì)肥胖大鼠白色脂肪棕色化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料60只雄性SD大鼠購于南京君科生物公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0001,將所有大鼠放在SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng),均自由攝食及飲水,每12 h光照/12 h黑暗,溫度為19～25 ℃,濕度為45%～55%。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 60只大鼠通過高脂喂食構(gòu)建肥胖大鼠模型。6周后超過普通飼料飼養(yǎng)大鼠平均體質(zhì)量10%為肥胖造模成功。有40只大鼠建模成功,將其隨機(jī)分為對(duì)照組、低氧組、低溫組、低氧低溫組,每組10只。其中對(duì)照組大鼠模型放置在正常環(huán)境中(氧濃度21%,實(shí)驗(yàn)溫度>4 ℃),低氧組大鼠放置在低氧常溫環(huán)境下(氧氣含量為16.2%,實(shí)驗(yàn)溫度>4 ℃),低溫組大鼠放置在冷環(huán)境中(氧氣含量為21%,實(shí)驗(yàn)溫度0 ℃±4 ℃),低氧低溫組大鼠大鼠放置在低氧/冷環(huán)境中(氧氣含量為16.2%,實(shí)驗(yàn)溫度0 ℃±4 ℃)。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)期間均普通飼料飼養(yǎng)。

1.2.2測(cè)量大鼠體質(zhì)量及體脂 觀察4組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、每周測(cè)量體質(zhì)量。4周時(shí)利用美國Columbus實(shí)驗(yàn)動(dòng)物代謝和Echo Medical Systems體成分分析儀測(cè)量分析系統(tǒng)分別檢測(cè)4組大鼠代謝率和體脂含量,隨后大鼠禁食18 h后經(jīng)乙醚麻醉后稱體質(zhì)量,眼球放血5 ml留取血清和分離腎周白色脂肪和肩胛棕色脂肪。各組小鼠血清樣本通過4 ℃離心后-20 ℃保存。

1.2.3蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)大鼠脂肪組織形態(tài)變化 新鮮的大鼠腎周白色脂肪和肩胛棕色脂肪固定于10%的甲醛溶液,固定時(shí)間約24 h。梯度乙醇脫水從80%乙醇、95%乙醇至無水乙醇約為4 h,組織透明后浸蠟,隨后以石蠟包埋和切片厚度一般為5 μm,常規(guī)HE染色。染色理想的切片在顯微鏡下應(yīng)是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)藍(lán)紅相映,色澤鮮艷,核質(zhì)對(duì)比明顯,核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見。最后利用日本Keyence顯微鏡進(jìn)行觀察分析。

1.2.4免疫熒光法檢測(cè)蛋白表達(dá) 新鮮的大鼠腎周白色脂肪和肩胛棕色脂肪經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡,每次10 min。采用PBS沖洗3次,每次5 min,然后加入驢血清置于室溫下封閉1 h,棄驢血清并加入一抗于4 ℃環(huán)境下孵育過夜;取出加二抗于室溫下孵育2 h,經(jīng)PBS沖洗后采用蒸餾水沖洗3次,每次5 min,加入含DAPI的抗淬滅封片劑,置于室溫下避光反應(yīng)5 min,封片然后置于顯微鏡下觀察。

1.2.5熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá) 利用TRIzol試劑分別從大鼠肩胛棕色脂肪及腎周白色脂肪中提取總RNA。每個(gè)循環(huán)94 ℃,變性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s。觀察過氧化物酶體增殖劑激活受體γ2(PPAR-γ2)、PRDM16 和解偶聯(lián)蛋白(UCP-1)基因的表達(dá)量,18s核糖體RNA(18S)作為參照。

1.2.6Western blot檢測(cè)脂肪蛋白表達(dá) 利用BCA蛋白試劑盒分別從大鼠肩胛棕色脂肪及腎周白色脂肪中提取總蛋白,分別取各組總蛋白30 μg,蛋白樣品用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳,濕法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉在室溫的條件下封閉1 h,按照說明書的方法加入一抗(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜后加入二抗lgG(1 ∶3 000),室溫條件下孵育1 h,顯色顯影,以β-actin蛋白為內(nèi)參計(jì)算UCP-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量、體脂比較與對(duì)照組相比,低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠體質(zhì)量、體脂率均下降(P<0.05);與低溫低氧組相比,低氧組、低溫組大鼠體質(zhì)量、體脂率均升高(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、體脂

2.2 大鼠脂肪組織HE染色細(xì)胞形態(tài)及脂肪細(xì)胞面積比較對(duì)照組大鼠脂肪組織內(nèi)脂肪細(xì)胞面積較大呈不規(guī)則形狀,可見大型脂滴;低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠脂肪組織內(nèi)脂肪細(xì)胞面積減小且數(shù)量增多,其中低溫低氧組細(xì)胞形態(tài)變化最為明顯。另外,在低溫低氧組大鼠腎周白色脂肪組織細(xì)胞可見有棕色化的趨勢(shì),見圖1～3。

圖1 各組大鼠肩胛棕色脂肪組織細(xì)胞形態(tài) HE染色 ×200A:對(duì)照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組

圖2 各組大鼠腎周白色脂肪組織細(xì)胞形態(tài) HE染色 ×200A:對(duì)照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組

圖3 各組大鼠脂肪面積比較A:對(duì)照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;與對(duì)照組比較:*P<0.05;與低溫低氧組比較:#P<0.05

2.3 大鼠脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達(dá)與對(duì)照組相比,低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠肩胛棕色脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達(dá)均升高(F=378.495、102.061、322.443,P<0.05),腎周白色脂肪組織PPAR-γ2基因表達(dá)降低(F=4.555,P<0.05)、PRDM16、UCP-1基因表達(dá)均升高(F=24.387、163.660,P<0.05)。與低溫低氧組相比,低氧組、低溫組大鼠肩胛棕色脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達(dá)均更低;低氧組、低溫組大鼠腎周白色組織PPAR-γ2基因表達(dá)更高,PRDM16、UCP-1基因表達(dá)更低(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 大鼠肩胛棕色脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達(dá)A:對(duì)照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;與對(duì)照組比較:*P<0.05;與低溫低氧組比較:#P<0.05

圖5 大鼠腎周白色脂肪組織PPAR-γ2、PRDM16、UCP-1基因表達(dá)A:對(duì)照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;與對(duì)照組比較:*P<0.05;與低溫低氧組比較:#P<0.05

2.4 大鼠脂肪組織UCP-1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比,低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠肩胛棕色脂肪組織與腎周白色脂肪組織UCP-1蛋白表達(dá)均升高(P<0.05);與低溫低氧組相比,低氧組、低溫組大鼠肩胛棕色脂肪組織與腎周白色脂肪組織UCP-1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),見圖6～10。

圖6 大鼠脂肪組織UCP-1蛋白表達(dá)A:對(duì)照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;與對(duì)照組比較:*P<0.05;與低溫低氧組比較:#P<0.05

圖7 大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1蛋白表達(dá)

圖8 大鼠腎周白色脂肪組織UCP-1蛋白表達(dá)

圖9 大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1免疫熒光染色A:對(duì)照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;綠色熒光:UCP-1蛋白;藍(lán)色熒光:DAPI

圖10 大鼠腎周白色脂肪組織UCP-1免疫熒光染色A:對(duì)照組;B:低氧組;C:低溫組;D:低溫低氧組;綠色熒光:UCP-1蛋白;藍(lán)色熒光:DAPI

3 討論

肥胖是目前威脅人類健康的重大問題,對(duì)于如何減控體質(zhì)量成為目前研究熱點(diǎn)及難點(diǎn)。低氧環(huán)境下的體質(zhì)量減輕是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的生理現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn),世居高原的藏族群體除體質(zhì)量較輕、體型較勻稱外,經(jīng)篩查該群體EGLN1基因和與脂代謝密切相關(guān)的PPARA基因表達(dá)也明顯降低[5]。本研究通過高脂喂食構(gòu)建肥胖大鼠模型,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低氧組、低溫組、低溫低氧組大鼠體質(zhì)量、體脂均降低,且低溫低氧組大鼠體質(zhì)量、體脂低于低氧組、低溫組,探究了低氧/冷暴露對(duì)肥胖大鼠模型白色脂肪棕色化的影響機(jī)制。

對(duì)于短期的高山跋涉和低氧訓(xùn)練減重等機(jī)制的研究結(jié)果雖然不一致,但都顯示出了短期低氧暴露對(duì)減重和脂代謝的促進(jìn)作用。有研究報(bào)道高山跋涉[6]和低氧訓(xùn)練[7]過程中體質(zhì)量降低主要由體脂率降低所致。國內(nèi)格日力 等[8]的研究顯示平原人暴露在海拔3.5 km以上高原環(huán)境后體質(zhì)量將降低,且與常氧環(huán)境比較,自然高原環(huán)境和人工模擬氧暴露更易致體質(zhì)量和體脂含量下降,減脂效果更好。有研究者通過免疫組化揭示了白色脂肪與棕色脂肪生理活動(dòng)的差異,白色脂肪的主要功能是將體內(nèi)多余的能量以三酰甘油的形式儲(chǔ)存起來,可以消耗能量熱,調(diào)節(jié)體溫[9-10]。調(diào)控體內(nèi)白色脂肪與棕色脂肪的含量與比例可消耗機(jī)體多余的能量并促進(jìn)局部甚或全身的脂肪消耗。 與白色脂肪棕色化、棕色脂肪代謝主要相關(guān)的經(jīng)典基因有脂形成基因PPAR-γ2、解偶聯(lián)蛋白UCP-1、脂肪分化的輔激活基因PRDM16等。在脂肪組織內(nèi),基因PRDM16可與PPAR-γ2結(jié)合使UCP1高表達(dá),觀察特定環(huán)境下三種基因的不同表達(dá),可推斷出白色脂肪棕色化及棕色脂肪內(nèi)脂代謝的動(dòng)態(tài)變化過程。

PPAR-γ是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,參與多種代謝過程中的基因調(diào)控,PPAR-γ活化能增加胰島素敏感脂肪細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)線粒體生成,增加UCP-1表達(dá),在脂肪組織分化中起著重要作用[11-13]。UCP-1是棕色脂肪組織發(fā)揮產(chǎn)熱活性最重要的分子。UCP-1對(duì)機(jī)體維持體溫非常重要,尤其是在嚙齒類動(dòng)物、新生兒和成年人群體,且其水平與肥胖相關(guān)的產(chǎn)熱功能密切相關(guān),是棕色脂肪細(xì)胞形成和活性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)[14-15]。PRDM16可看作是棕色脂肪分化的輔激活因子,可調(diào)控PPARα、CtBP、PGC-1α、PPAR-γ等的轉(zhuǎn)錄活性,誘導(dǎo)棕色脂肪特有基因的表達(dá),同時(shí)使白色脂肪的基因關(guān)閉。PPAR-γ是PRDM16的受體,一些人體研究[16]顯示,人體白色脂肪分化為棕色脂肪主要依賴PRDM16。PRDM16的表達(dá)又會(huì)促進(jìn)白色脂肪中UCP1的表達(dá),即白色脂肪棕色化,從而促進(jìn)向棕色脂肪的分化[17]。所以PRDM16通過調(diào)控PPAR-γ并激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄功能可刺激棕色脂肪細(xì)胞的形成,在促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。

該研究顯示短期低氧或寒冷環(huán)境下肥胖小鼠體脂率均降低, 白色脂肪組織中的基因PPAR-γ2表達(dá)下調(diào)、PRDM16與UCP-1表達(dá)上調(diào),考慮為低氧或寒冷可能促進(jìn)了PPAR-γ2與PRDM16的結(jié)合,并抑制了前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在棕色脂肪組織中PPAR-γ2與 PRDM16的表達(dá)上調(diào),而UCP-1表達(dá)上調(diào)差異更顯著,表明棕色脂肪細(xì)胞形成明顯增加,棕色脂肪組織代謝加快,產(chǎn)熱活性加大,低氧/冷暴露環(huán)境加深加快了這一過程。

綜上所述,低氧/冷暴露可通過調(diào)控脂肪內(nèi)PPAR-γ2、PRDM16通路使UCP-1高表達(dá),誘導(dǎo)白色脂肪棕色化并影響大鼠體質(zhì)量。