人參皂苷Rg1介導HSPA8自噬途徑改善帕金森小鼠黑質神經元損傷

陳金友 高越

帕金森病（PD）是一種臨床常見的神經系統退行性疾病，由腦部黑質致密部紋狀體多巴胺（DA）能神經元發生進行性變性引起，主要的癥狀表現為靜止性震顫、運動遲緩、姿勢步態異常等，臨床上較常用左旋多巴以外源性方式補充腦內DA 以緩解癥狀［1］。目前，自噬缺陷被認為是引起PD 中α-Synuclein 等異常蛋白質積累，加劇神經元損傷的重要因素［2］。熱休克蛋白A8（HSPA8）組成性表達于細胞胞質內，具有介導細胞自噬作用［3］。人參皂苷Rg1 是人參的活性成分，可調節神經遞質的釋放和腦內蛋白質合成，具有神經保護作用［4］。研究證實，人參皂苷Rg1 對PD 小鼠黑質內聚集的α-Synuclein 具有降解作用［5］。因此，本研究通過建立PD 小鼠模型，探討人參皂苷Rg1 介導HSPA8 自噬途徑對DA 小鼠的神經元保護作用，以明確人參皂苷Rg1 治療PD 的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：48 只健康雄性C57BL/6J 小鼠，8~10 周齡，體質量（25±5）g，購于北京維通利華公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006）］。正常飼養環境下飼養于浙江鷹旸生物科技有限公司［許可證號：SYXK（浙）2021-0033）］。所用動物實驗方法與處理措施均由浙江鷹旸醫藥研發有限公司實驗動物倫理委員會批準并執行。（2）主要實驗試劑：人參皂苷Rg1、VER-155008F（HSPA8 抑制劑）購于麥克林（貨號：G909436、C872629）；1-甲基-4 苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）購于上海源葉生物科技有限公司（貨號：S31504）；HSPA8、α-Synuclein、絡氨酸氫化酶（TH）、p62 抗體購于美國Proteintech 公司（貨號：10654-1-AP、10842-1-AP、25859-1-AP、18420-1-AP）；α-Synuclein、HSPA8、TH、LC3-I/II、p62、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸肽酶3（Caspase 3）、Bcl-2 關聯X（Bax）蛋白抗體購于美國Affinity 公司（貨號：AF0402、AF5187、AF6113、AF5402、AF5384、AF6139、AF6311、AF0120）；Tunel 試劑盒購于北京索萊寶公司（貨號：G1501）；Nissl 染色試劑盒購于武漢谷歌生物公司（貨號：G1036）。（3）主要實驗設備：小鼠轉棒實驗儀購于SANS 公司；小鼠曠場實驗軌跡分析儀購于上海欣軟公司；化學發光儀購于上海勤翔公司；熒光顯微鏡購于日本尼康公司。

1.2 方法 （1）PD 小鼠模型建立：按照文獻報道的方法對小鼠進行造模［6］。30 mg MPTP 溶于10 mL 0.9%氯化鈉溶液中，腹腔注射30 mg/kg MPTP 對小鼠進行PD造模，連續注射7 d，NC 組小鼠腹腔注射10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液代替。（2）分組及給藥：小鼠隨機分為對照組（NC 組）、PD 組、Rg1-1 組（1 mg/kg Rg1）、Rg1-5組（5 mg/kg Rg1）、Rg1-10 組（10 mg/kg Rg1）、Rg1-20組（20 mg/kg Rg1）、Rg1-40 組（40 mg/kg Rg1）、Rg1-40+VER-155008 組（40 mg/kg Rg1+89.9 μmol/kg VER-155008），每組各6 只。NC 和PD 組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液，各藥物組小鼠每天灌胃相應劑量Rg1，Rg1-40+VER-155008 組另需腹腔注射VER-155008，1 次/d，連續10 d。（3）小鼠行為學觀察實驗：準備小鼠轉棒實驗儀、爬桿和實驗箱子。測定小鼠在轉棒上的停留時間和完成爬桿的所需時間，小鼠曠場實驗軌跡分析儀安裝于實驗箱內記錄小鼠在箱子的行動軌跡，記錄小鼠實驗內穿越中間區域次數和運動路程數，評價小鼠整體運動行為能力。實驗前3 d 讓小鼠熟悉實驗流程和箱子環境，不同小鼠測試前需用75%乙醇消除氣味以免造成實驗干擾。（4）小鼠腦黑質Nissl 染色：制備石蠟切片。常規脫蠟至水。Nissl 染色液均勻覆蓋切片，放入預熱后烤箱內染色孵育20 min，清洗，烤箱烘干，二甲苯透明，中性樹膠封固。（5）小鼠腦黑質免疫組化染色：石蠟切片常規脫蠟至水，修復。封閉后加入HSPA8、α-Synuclein 抗體孵育過夜。標記的二抗孵育50 min。清洗，顯色5 min，復染細胞核，常規脫水封片，鏡檢。陽性表達呈棕黃色。（6）小鼠腦黑質免疫熒光檢測：石蠟切片常規脫蠟至水，修復。P62、TH、LC3 抗體孵育，封閉30 min，吸棄多余液體，加入標記的二抗，避光孵育50 min。搖床脫色清洗3 次，DAPI染液避光染10 min，PBS 清洗3 遍。封片，熒光顯微鏡下觀察。（7）小鼠腦黑質Tunel 染色：石蠟切片常規脫蠟至水，修復。Tunel 染液均勻覆蓋切片，37℃水浴孵育。清洗，DAPI 室溫下復染10 min，搖床清洗，封片，鏡檢拍照發熒光的Tnnel 陽性細胞。（8）Western blot 檢測小鼠腦黑質相應蛋白表達：小鼠黑質組織制備為勻漿，離心提取蛋白，測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白，轉膜。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，清洗，孵育α-Synuclein、HSPA8、TH、caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3-II、LC3-I、P62 稀釋的一抗抗體，4℃搖床振蕩過夜。清洗，封閉后二抗孵育。ECL 化學發光儀顯影，測定蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS 統計軟件。符合正態分布計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。偏態分布則采用Kruskal-Wallis H 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠行為表現 與NC 組比較，PD 組小鼠轉棒停留時間顯著縮短、完成爬桿所需時間顯著延長、穿越箱子中間區域次數及總路程顯著減少，整體運動行為能力降低（P<0.01）。與PD 組比較，不同劑量Rg1 組的小鼠的整體運動行為能力增強，以Rg1-40 組小鼠的整體運動能力改善最為顯著（P<0.05）。而與Rg1-40 組比較，Rg1-40+VER155008 組小鼠的整體行為運動能力顯著下降（P<0.01）。見表1。

表1 小鼠行為學變化情況［（±s），n=6］

表1 小鼠行為學變化情況［（±s），n=6］

注：與NC 組比較，▲▲P<0.01；與PD 組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與Rg1-40 組比較，##P<0.01

組別 轉棒停留時間（s）爬桿時間（s）中間區域穿越次數（次）總路程（mm）NC 組 293.72±29.92 4.97±0.45 29.27±2.94 27,308.05±2,636.36 PD 組 176.82±14.93▲▲11.52±1.12▲▲ 11.52±1.2▲▲ 12,774.5±1,223.08▲▲Rg1-1 組 185.53±16.71 10.65±1.18 14.55±1.53★★ 15,533.83±1,764.67★Rg1-5 組 192.65±20.09 8.52±0.86★★ 14.97±1.48★★ 16,000.35±1,516.04★★Rg1-10 組 216.07±23.04★ 8.87±0.87★★ 20.87±2.12★★ 17,704.58±1,689.53★★Rg1-20 組 252.15±25.76★★ 6.53±0.42★★ 23.57±2.01★★ 19,075.82±1,529.88★★Rg1-40 組 278.22±28.4★★ 5.38±0.47★★ 26.7±2.45★★ 21,992.85±2,316.21★★Rg1-40+VER155008 組 223.55±21.62## 7.78±0.77## 16.92±1.59## 15,905.72±1,296.41##

2.2 各組小鼠腦組織Nissl 染色結果 NC 組小鼠黑質神經元細胞核仁明顯，可見淡藍色的尼氏小體出現于胞漿。與NC 組比較，PD 組小鼠神經元細胞皺縮，尼氏小體數量減少，核仁小時。與PD 組比較，不同劑量Rg1 組的神經元細胞形態改善，尼氏小體數量增加；與Rg1-40 組相比，Rg1-40+VER155008 組小鼠經元細胞胞漿加深，尼氏小體減少，見圖1。

圖1 各組小鼠神經元細胞病理改變（Nissl染色×400）

2.3 各組小鼠腦組織α-Synuclein、HSPA8 含量 與NC 組比較，PD 組小鼠腦組織中α-Synuclein 含量增加，HSPA8 含量降低（P<0.01）。與PD 組比較，Rg1-10、Rg1-20、Rg1-40 組小鼠黑質內α-Synuclein 含量降低，HSPA8 含量增加（P<0.01）。與Rg1-40 組相比，Rg1-40+VER155008 組小鼠黑質組織α-Synuclein 含量增加，HSPA8 含量降低（P<0.05），見圖2、表2。

圖2 小鼠腦組織α-Synuclein、HSPA8表達（免疫組化×200）

表2 各組小鼠腦組織α-Synuclein、HSPA8表達比較［（±s），n=6］

表2 各組小鼠腦組織α-Synuclein、HSPA8表達比較［（±s），n=6］

注：與NC 組比較，▲▲P<0.01；與PD 組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與Rg1-40 組比較，#P<0.05，##P<0.01

指標 NC 組 PD 組 Rg1-1 組 Rg1-5 組 Rg1-10 組 Rg1-20 組 Rg1-40 組 Rg1-40+VER155008 組α-Synuclein 0.13±0.01 0.25±0.02▲▲ 0.23±0.02 0.22±0.02 0.19±0.02★★ 0.18±0.02★★ 0.16±0.02★★ 0.19±0.02#HSPA8 0.25±0.03 0.13±0.01▲▲ 0.14±0.01 0.14±0.02 0.17±0.02★★ 0.19±0.02★★ 0.21±0.03★★ 0.18±0.02#

2.4 各組小鼠腦組織p62、TH、LC3 含量 與NC 組比較，PD 組小鼠黑質內p62 含量增加，TH、LC3 含量降低（P<0.01）。與PD 組比較，不同劑量Rg1 組小鼠黑質內p62 含量降低、LC3、TH 含量增加（P<0.05）。與Rg1-40 組比較，Rg1-40+VER155008 組小鼠黑質內p62 含量增加，TH、LC3 含量降低（P<0.05），見表3、圖3。

圖3 各組小鼠腦組織p62、TH、LC3熒光表達（免疫熒光×400）

表3 各組小鼠腦組織p62、TH、LC3表達比較［（±s），n=6］

表3 各組小鼠腦組織p62、TH、LC3表達比較［（±s），n=6］

注：與NC 組比較，▲▲P<0.01；與PD 組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與Rg1-40 組比較，#P<0.05，##P<0.01

指標 NC 組 PD 組 Rg1-1 組 Rg1-5 組 Rg1-10 組 Rg1-20 組 Rg1-40 組 Rg1-40+VER155008 組p62 20.34±2.16 35.6±2.91▲▲ 32.42±3.42 29.46±1.34 5.27 37.86±3.91▲▲ 39.57±2.22 41.77±3.6★★ 25.09±1.85★★ 24.1±1.79★★ 21.75±1.83★★ 24.49±1.73#TH 56.99±1 43.92±4.29★ 48.53±5.08★★ 53.56±3.23★★ 46.93±4.26#LC3 43.61±3.25 20.91±2.32▲▲ 22.26±2.00 27.28±1.58★★ 30.54±2.39★★ 31.44±4.00★★ 32.65±2.06★★ 27.62±1.86##

2.5 各組小鼠腦組織細胞凋亡情況 與NC組比較，PD組小鼠黑質神經元細胞凋亡顯著增加（P<0.01）。與PD組比較，Rg1-5、Rg1-10、Rg1-20、Rg1-40 組小鼠黑質神經元細胞凋亡減少（P<0.01）。與Rg1-40 組比較，Rg1-40+VER155008 組小鼠黑質神經元細胞凋亡增加（P<0.01），見表4、圖4。

圖4 各組小鼠腦組織凋亡小體染色結果（Tunel染色×400）

表4 各組小鼠黑質神經元細胞凋亡比較［（±s），n=6］

表4 各組小鼠黑質神經元細胞凋亡比較［（±s），n=6］

注：與NC 組比較，▲▲P<0.01；與PD 組比較，★★P<0.01；與Rg1-40 組比較，##P<0.01

組別 Tunel 陽性（%）NC 組 2.58±0.23 PD 組 26.83±2.40▲▲24.13±2.41 17.58±2.49★★組 15.74±1.32★★Rg1-1 組Rg1-5 組Rg1-10 Rg1-20 組 13.86±3.43★★Rg1-40 組 12.25±1.18★★Rg1-40+VER155008 組 15.83±2.01##

2.6 各組小鼠腦組織測定蛋白表達情況 與NC 組比較，PD 組小鼠黑質內α-Synuclein、Caspase-3、Bax、p62 蛋白表達顯著增加，HSPA8、TH、Bcl-2、LC3-II/LC3-I 蛋白表達顯著降低（P<0.01）。與PD 組比較，不同劑量Rg1 組小鼠黑質內α-Synuclein、Bax、p62、caspase-3 蛋白表達降低，HSPA8、TH、Bcl-2、LC3-II/LC3-I 蛋白表達增加（P<0.05）。與Rg1-40 組比較，Rg1-40+VER155008 組小鼠黑質內α-Synuclein、Caspase-3、Bax、p62 蛋白表達顯著增加，HSPA8、TH、Bcl-2、LC3-II/LC3-I 蛋白表達顯著降低（P<0.05）。見圖5。

圖5 各組小鼠黑質組織內檢測蛋白表達比較

3 討論

PD 的主要病理改變為α-Synuclein 錯誤折疊形成聚集體，并在神經元細胞間不斷傳播加重神經元損傷，導致PD 的發生與進展［7］。自噬為細胞清除過多異常蛋白以維持細胞正常功能所必需，自噬阻滯與激活能夠相應增加和減少致病性α-Synuclein 的聚集［2］。研究表明，攜帶自噬基因變異的PD 患者的神經元細胞內的自噬活性降低，對α-Synuclein 蛋白的清除應答也相應降低［8］。LC3-I 通過脂化為LC3-II 作為選擇性自噬受體為細胞啟動自噬程序的關鍵，LC3-II/LC3-I、p62 蛋白可作為細胞自噬活性的生物標志［8-9］。周鴻雁等［10］消除線粒體復合物I 抑制劑魚藤酮對線粒體的抑制作用后，DA 模型細胞LC3-II 表達增加、p62 表達降低，同時促凋亡Bax 蛋白表達下降、抑凋亡Bcl-2 蛋白表達增加，提示自噬活性增強對DA 細胞模型具有保護作用。李和梅等［11］發現人參皂苷Rg1 干預Aβ 損傷的神經細胞后，細胞的LC3-II/LC3-I 蛋白表達上調，線粒體膜電位水平上升，細胞活力增加，提示人參皂苷Rg1 可介導自噬途徑減少神經細胞的毒性損傷。

自噬的調控機制復雜，而HSPA8 是介導細胞線粒體自噬途徑的主要載體［3］。研究顯示，魚藤酮暴露可下調PD 細胞模型中HSPA8 表達，導致α-Synuclein 蛋白異常聚集，增加神經元細胞毒性［12］。LH 為DA 的合成限速酶，腦組織內其低表達與PD 發生和發展相關［13］。本研究結果顯示，PD 小鼠整體行為運動能力下降，腦組織內HSPA8、TH 蛋白含量表達下調，自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I 蛋白表達降低、p62 蛋白表達增加，而α-Synuclein 蛋白含量表達增加，神經元細胞尼氏小體數量下降、凋亡增加，相應促凋亡Caspase-3、Bax 蛋白表達顯著增強、抑凋亡Bcl-2 蛋白表達降低，表明PD小鼠DA 神經元自噬活性降低、神經元細胞損傷嚴重。而不同劑量人參皂苷Rg1 單獨干預后，PD 小鼠整體行為運動能力明顯改善，神經元尼氏小體數量增加、凋亡減少，黑質組織內HSPA8、TH、Bcl-2、LC3-II/LC3-I蛋白表達上調，α-Synuclein、Caspase-3、Bax 蛋白表達下降，表明人參皂苷Rg1 對可上調PD 小鼠黑質神經元自噬活性，具有神經保護作用。而當HSPA8 被抑制后，40 mg/kg 人參皂苷Rg1 對PD 小鼠的行為運動能力的改善作用下降，腦組織內α-Synuclein 蛋白表達增加，神經元細胞尼氏小體數量減少、凋亡增加，LC3-II/LC3-I、TH、Bcl-2 蛋白表達下降，p62、Caspase-3、和Bax 蛋白表達增加，推測人參皂苷Rg1 可能介導HSPA8 自噬途徑增強DA 神經元細胞自噬活性，發揮對PD 小鼠的神經保護作用。

綜上所述，本研究表明HSPA8 在PD 小鼠黑質神經元細胞內低表達與神經損傷有關，而人參皂苷Rg1 可介導HSPA8 的自噬途徑減少神經元細胞損傷，從而起到PD 小鼠的神經保護作用。