夏枯草乙酸乙酯提取物對一氧化氮合酶作用的研究

鄭洋濱，洪燕，龔瑋，周年，劉寧

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

夏枯草主要有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血壓等藥理作用［1］，具有清火除熱，清肝明目，散結消腫等功效［2］，可有效擴張血管，具有良好的降壓效果［3］。在前期的研究中發現，夏枯草乙酸乙酯提取物有內皮依賴性血管舒張作用，且其血管舒張作用與一氧化氮（NO）的釋放和一氧化氮合酶（NOS）的調節有關［4］。夏枯草乙酸乙酯提取物多為揮發油、萜類、黃酮、甾醇類和香豆素類。已有文獻［5-6］報道夏枯草中的黃酮類化合物主要有山柰酚、槲皮素、蘆丁等，均是有明確舒張血管作用的化合物，均能導致內皮依賴性大鼠胸主動脈舒張。為了進一步闡明夏枯草乙酸乙酯提取物的降壓機制，本課題組對其在內皮細胞中的作用機制進行更深入研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人臍靜脈內皮細胞融合細胞（EA·hy926），購自上海語純生物科技有限公司。

1.2 實驗樣品及主要試劑

夏枯草藥材購自毫州市中信中藥飲片廠，批號：1 904001；人內皮型一氧化氮合酶（eNOS）測定劑盒（上海泛柯實業有限公司，貨號：F0465-B）；NO 測定試劑盒（碧云天生物技術公司，貨號：NOS0021S）；BCA 蛋白檢測試劑盒（碧云天生物技術公司，貨號：NO.P0012S）；兔抗人窖蛋白-1（Cav-1）多克隆抗體（批號：0209500101），兔抗人內皮型一氧化氮合酶（eNOS）多克隆抗體（批號：5500004931），兔抗人磷酸化內皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）多克隆抗體（批號：2101760101），兔抗人熱激蛋白90（HSP-90）多克隆抗體（批號：4000001169）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；小鼠抗人β-action（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：#37u8343），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（批號：22221），辣根酶標記山羊抗兔IgG（批號：20121）均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 實驗儀器

MB614S 電子天平（d=0.1mg），PowerPacTM Basic電泳儀，IC1000 細胞計數器，ChemiDoc MP 凝膠成像儀，MULTISKAN GO 酶標儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 試驗樣品配制 稱取夏枯草乙酸乙酯干浸膏2.03 g 加二甲基亞砜（DMSO）10 mL 溶解為母液。用DMEM 培養基將母液稀釋至1 500.00、1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.20、15.60 μg/mL的樣品。

1.4.2 細胞毒性試驗 取對數生長期細胞，按每孔1×104個細胞接種于96 孔板。待細胞鋪滿80%，加入“1.4.1”項下樣品，空白對照組給予5‰DMSO的培養基，每組設8 個復孔。24 h 后每孔加入MTT 20 μL，CO2培養箱孵育4 h，棄去孔內液體，每孔加DMSO150 μL 溶解，振蕩10 min，在570 nm和630 nm 雙波長下測定吸光度。計算相對增殖度（RGR），RGR=實驗組吸光度/空白對照組吸光度×100%。RGR ≥80%則認為無細胞毒性作用［7］。

1.4.3 對NO 濃度和NOS 含量的影響 取對數生長期細胞，按每孔5×105個細胞接種于6 孔板。待細胞鋪滿80%，加入31.20、15.60、7.80 μg/mL 的樣品作為高、中、低劑量組，陰性對照組給予5‰DMSO的培養基。24 h 后收集上清液，檢測細胞外NO 含量，每組重復測定8 次。將6 孔板置于冰上，每孔加4 ℃預冷PBS 洗滌3 次，再加200 μL 細胞裂解液，用槍吹打數下，將裂解液和細胞碎片轉移至1.5 mL的離心管中，14 000 g 離心5 min，離心半徑7 cm。取上清液檢測細胞內NO 和eNOS 含量，每組重復測定8 次。

1.4.4 Western blot 檢測蛋白表達 BCA 蛋白測定試劑盒檢測細胞裂解液中蛋白質含量，取等量蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，而后將蛋白轉印至PVDF 膜上，封閉液孵育1 h 后，根據marker 標記剪取目的蛋白eNOS、p-eNOS、HSP-90 和Cav-1 的條帶，分別加入經1∶500 稀釋后的兔抗人eNOS、p-eNOS、HSP-90、Cav-1 多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜后用1∶2 000 稀釋的辣根酶標記山羊抗兔IgG 在脫色搖床上室溫孵育1 h。孵育后的PVDF 膜經3 次洗滌，加入顯色劑顯色，在凝膠成像系統中拍照，采用Image J 軟件對目的蛋白進行灰度分析［8］，重復試驗3 次。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 MTT 實驗結果

實驗結果表明，當夏枯草乙酸乙酯提取物濃度大于31.20 μg/mL 時，會影響EA·hy926 的增殖度，見圖1。故后續實驗選擇31.20、15.60、7.80 μg/mL作為高、中、低劑量組。

圖1 夏枯草乙酸乙酯提取物MTT實驗結果

2.2 對NO 釋放量及eNOS 含量的影響

中、高劑量組細胞內NO 和eNOS 含量高于陰性對照組（P＜0.05）。高、中、低三個劑量組對細胞外NO 含量均無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 夏枯草乙酸乙酯提取物對NO釋放量及eNOS含量的影響（，n=8）

表1 夏枯草乙酸乙酯提取物對NO釋放量及eNOS含量的影響（，n=8）

注：與陰性對照組比較，aP＜0.05；eNOS，內皮型一氧化氮合酶；NO，一氧化氮。

2.3 對相關蛋白表達的影響

中、高劑量組細胞內eNOS 和HSP-90 的蛋白表達均高于陰性對照組（P＜0.05），Cav-1 的蛋白表達均低于陰性對照組（P＜0.05）。高劑量組p-eNOS 蛋白表達高于陰性對照組（P＜0.05）。見表2、圖2。

表2 夏枯草乙酸乙酯提取物對eNOS、p-eNOS、Cav-1和HSP-90蛋白表達的影響（，n=3）

表2 夏枯草乙酸乙酯提取物對eNOS、p-eNOS、Cav-1和HSP-90蛋白表達的影響（，n=3）

注：表格數據為各蛋白灰度值，以β-actin為對照；與陰性對照組比較，aP＜0.05；eNOS，內皮型一氧化氮合酶；p-eNOS，磷酸化內皮型一氧化氮合酶；Cav-1，窖蛋白-1；HSP-90，熱激蛋白90。

圖2 夏枯草乙酸乙酯提取物對相關蛋白表達的影響

3 討論

Cav-1 是胞膜窖的膜整合蛋白，主要分布于內皮細胞、平滑肌細胞等細胞中，負責調控眾多定位于胞膜窖的信號分子的活性。在靜息狀態下，eNOS與Cav-1 結合，處于失活狀態，當細胞受外界信號刺激時，eNOS 與Cav-1 分離，eNOS 被激活，從而產生NO［9-12］。HSP-90 作為分子伴侶蛋白，細胞受外界信號刺激時，HSP-90 會占據eNOS 上的Cav-1結合位點，eNOS 與HSP-90 的結合促進了Akt 的聚集，Akt 使eNOS 的Ser1179 和Thr497 磷酸化，促進eNOS 釋放NO，舒張血管，降低血壓。因此，降低Cav-1 表達，增加HSP-90 表達，可以促進eNOS 釋放NO［13-15］。

本次實驗結果表明，夏枯草乙酸乙酯提取物能增加細胞內eNOS 含量，促進NO 釋放，其通過提高EA·hy926 內eNOS 和p-eNOS 的蛋白表達，增加細胞內eNOS 的含量和活性，使NO 釋放增多。此外夏枯草乙酸乙酯提取物還能增加HSP-90 的蛋白表達，降低Cav-1 的蛋白表達，使eNOS 與HSP-90 結合增多，促進eNOS 磷酸化，增加NO 的釋放。然而，本次實驗未對夏枯草乙酸乙酯提取物進行進一步的分離、純化；因此，夏枯草提取物中具體哪一類化合物起到增加NO 釋放作用將是課題組未來的研究方向。

綜上所述，夏枯草乙酸乙酯提取物的舒張血管作用與增加血管內皮細胞的NO 釋放有關，其能夠通過增加血管內皮細胞內eNOS、p-eNOS 和HSP-90 的蛋白表達，降低Cav-1 的蛋白表達，增加細胞內eNOS 的含量和活性，促進eNOS 釋放NO，從而舒張血管，降低血壓。本次實驗基本闡明了夏枯草乙酸乙酯提取物在內皮細胞中的作用機制，為夏枯草進一步的開發利用提供理論基礎。