甘草酸介導(dǎo)miRNAs對(duì)大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

從美麗,馬依熱·努爾買賣提,周 蓓,陳瑞花,王 忠,朱虎虎,趙效國(guó)

酒精性肝損傷(alcoholic liver disease,ALD)又稱酒精性肝病,已成為一個(gè)全球性的健康問題[1]。酗酒是引起酒精性肝損傷的主要原因,長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)引起脂肪變性、脂肪性肝炎、肝硬化及終末期肝細(xì)胞癌[2]。甘草酸(glycyrrhizic acid,GL)是甘草的主要活性成分,具有保肝、抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用,能增強(qiáng)肝臟的解毒功能,減輕肝臟損傷等藥理作用,在預(yù)防和治療酒精性肝病中已被應(yīng)用[3]。然而,甘草酸治療酒精性肝損傷的分子機(jī)制及作用靶點(diǎn)仍有待闡明,該研究利用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)甘草酸在治療大鼠酒精性肝損傷過程中miRNA表達(dá)變化,探討其可能的作用機(jī)制和潛在的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑健康SPF級(jí)雄性SD大鼠45只,體質(zhì)量180～220 g,新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(新)2018-0002。在新疆醫(yī)科大學(xué)屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室中完成,合格證號(hào):SYXK(新)2018-0003。56°牛欄山二鍋頭購(gòu)于北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司(批號(hào):20160430);甘草酸購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。miRNeasy Mini Kit(貨號(hào):271004)購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司。miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit(貨號(hào):KR211)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號(hào):Q712-02)購(gòu)于南京諾唯贊生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 模型制備將45只SD大鼠隨機(jī)分成甘草酸組、模型組和對(duì)照組,模型組每只大鼠按10 ml/(kg·d)的劑量白酒灌胃;甘草酸組在灌胃白酒的同時(shí),每只按11.75 mg/(kg·d)的劑量,給予甘草酸灌胃;對(duì)照組每天給予同等劑量的蒸餾水灌胃。持續(xù)灌胃8周后,所有大鼠禁食12 h,剖取肝臟,放入液氮中保存。

1.3 血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)測(cè)定使用獸用全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào):BS-240VET,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司),測(cè)定血清AST和ALT水平。

1.4 肝臟miRNA的提取取30 mg肝臟組織使用miRNeasy Mini Kit提取miRNA,抽提所得miRNA使用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)進(jìn)行miRNA定量,并使用Agilent Bioanalyzer 2100進(jìn)行miRNA質(zhì)量檢測(cè)。miRNA質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為RIN >7且28S/18S >0.7。

1.5 芯片實(shí)驗(yàn)采用Agilent Rat miRNA (8×15 K) V21.0芯片(design ID: 070154)(美國(guó)安捷倫公司)檢測(cè)甘草酸組和模型組大鼠肝臟中miRNA表達(dá)。對(duì)樣本中的miRNA分子進(jìn)行熒光標(biāo)記,在滾動(dòng)雜交爐中進(jìn)行芯片雜交,雜交完成后在洗缸中洗片。

1.6 GO注釋和KEGG通路分析利用基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.geneonto logy.org)對(duì)差異miRNA靶基因進(jìn)行GO分類注釋,包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能;利用KEGG Pathway(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異miRNA靶基因進(jìn)行信號(hào)通路分析。GO注釋及KEGG通路分析均以P<0.05作為顯著性富集標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 差異miRNA-mRNA-Pathway調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用miRWalk預(yù)測(cè)軟件對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),結(jié)合能大于等于28為篩選條件,之后將靶基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系,置信度≥0.4,degree大于1為篩選條件;同時(shí)聯(lián)合KEGG Pathway富集結(jié)果及String計(jì)算結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.8 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)以U6為內(nèi)參對(duì)挑選的差異miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;使用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;50 μl反應(yīng)體系中加入上下游引物(10 μmol/L)各2 μl,ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 25 μl,cDNA 5 μl,補(bǔ)水至50 μl。反應(yīng)條件為:95 ℃、5 min;95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,共40個(gè)循環(huán)。采用ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 芯片數(shù)據(jù)分析芯片結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描,用Feature Extraction software 11.5讀取原始數(shù)據(jù),質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用R包Quantile算法進(jìn)行歸一化處理。采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),通過P值和foldchange值對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異篩選和統(tǒng)計(jì),本研究將P<0.05、foldchange≥1.5設(shè)定為顯著差異表達(dá)的閾值。

2 結(jié)果

2.1 甘草酸對(duì)大鼠酒精性肝損傷的影響大鼠連續(xù)灌胃乙醇后會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷、脂肪變性,主要表現(xiàn)為血清AST和ALT水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.366,P<0.05;t=7.784,P<0.05);甘草酸可改善乙醇引起的血清AST和ALT升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.526,P<0.05;t=6.448,P<0.05)。見圖1。HE染色后,正常組肝臟結(jié)構(gòu)清晰,邊界清楚;模型組有明顯的肝細(xì)胞脂肪變性,部分肝細(xì)胞腫脹、變性壞死,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞核固縮;甘草酸組病理改變明顯減少,部分損傷細(xì)胞得到修復(fù),肝臟組織結(jié)構(gòu)與正常組比較無明顯差異。見圖2。提示本研究造模成功,且甘草酸保護(hù)效果明顯,可用于miRNA基因芯片分析。

圖1 甘草酸對(duì)大鼠血清AST和ALT水平的影響A:血清AST水平;B:血清ALT水平;與正常組比較:**P<0.01

圖2 各組大鼠肝臟組織形態(tài) HE染色 ×100A:正常組;B:模型組;C:甘草酸組

2.2 差異表達(dá)miRNA分析以P<0.05,foldchange≥1.5為差異篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)甘草酸組和模型組間差異表達(dá)miRNA進(jìn)行篩選,芯片分析結(jié)果顯示,甘草酸組顯著差異表達(dá)miRNA有13個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的有10個(gè),下調(diào)的有3個(gè),上調(diào)的miR-295-5p、miR-292-5p、miR-190b-5p和miR-291b,下調(diào)的miR-107-3p、miR-181b-1-3p差異較為顯著。見表1。圖3展示了甘草酸組與模型組之間差異表達(dá)miRNA聚類圖。

表1 差異表達(dá)miRNA信息表

圖3 甘草酸組與模型組差異miRNA的聚類圖M_1、M_2、M_3: 模型組;G_3、G_1、G_2: 甘草酸組

2.3 差異miRNA GO富集分析使用miRWalk對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),結(jié)合能≥28的靶基因共有913個(gè)。為更好地了解差異miRNA可能參與的生物學(xué)功能,對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果顯示差異表達(dá)miRNA主要與細(xì)胞黏附、抗氧化活性、代謝過程、生物過程調(diào)控、細(xì)胞殺傷、免疫系統(tǒng)等功能相關(guān)。圖4展示了差異miRNA靶基因參與的GO功能。

圖4 差異miRNA參與的GO條目

2.4 差異miRNA Pathway富集分析為進(jìn)一步探討甘草酸在治療酒精性肝損傷病變過程中所涉及的信號(hào)通路,對(duì)差異miRNA靶基因進(jìn)行了KEGG Pathway富集分析。結(jié)果顯示,以P<0.05為顯著標(biāo)準(zhǔn),共有108個(gè)信號(hào)通路被顯著富集,主要涉及MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、wnt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、癌癥等信號(hào)通路。圖5列出了差異miRNA靶基因參與的部分信號(hào)通路。

圖5 差異miRNA參與的部分信號(hào)通路

2.5 差異miRNA-mRNA-Pathway網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過String數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析差異miRNA靶基因編碼蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系,同時(shí)聯(lián)合KEGG Pathway富集分析結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果顯示:有12個(gè)miRNA與肝損傷相關(guān)通路有關(guān)聯(lián),見圖6。從圖中可以看出:miR-615、miR-107-3p、miR-292-5p位于網(wǎng)絡(luò)中心樞紐,為甘草酸治療酒精性肝損傷的關(guān)鍵miRNA;同時(shí),MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路為關(guān)鍵信號(hào)通路,參與多個(gè)miRNA及相關(guān)靶基因的調(diào)控。

圖6 差異miRNA-mRNA-Pathway調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.6 熒光定量PCR分析選取4個(gè)miRNA,其中上調(diào)miRNA 2個(gè),為miR-295-5p、miR-292-5p;下調(diào)miRNA 2個(gè),分別為miR-107-3p、miR-615,以U6為內(nèi)參,對(duì)其進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證分析。qPCR結(jié)果顯示以上4個(gè)miRNA在甘草酸組與模型組間表達(dá)變化模式與miRNA芯片結(jié)果一致(圖7),表明該研究利用miRNA芯片檢測(cè)獲得的差異miRNA結(jié)果是準(zhǔn)確可信的。

圖7 差異miRNA的qRT-PCR結(jié)果

3 討論

ALD仍然是全球發(fā)病和死亡的主要原因,更是我國(guó)嚴(yán)重的健康問題。甘草酸具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤作用,同時(shí)具有心臟包含和神經(jīng)保護(hù)作用,在治療許多疾病方面具有巨大的應(yīng)用潛力[4];已被應(yīng)用于肝病、皮膚炎癥性疾病、淋巴樣惡性腫瘤、新冠病毒等疾病治療中[5-7]。盡管甘草酸已被作為預(yù)防和治療ALD的替代方案,但具體的分子機(jī)制及作用靶點(diǎn)并不是很清楚。本研究通過檢測(cè)甘草酸組和模型組肝臟miRNAs變化,探討miRNA在甘草酸治療酒精性肝損傷過程中發(fā)揮的作用及調(diào)控的通路,了解甘草酸作用的具體分子機(jī)制和靶點(diǎn)。

miRNA是一類非編碼單鏈小RNA,可以通過促進(jìn)靶基因降解或抑制翻譯調(diào)控靶基因表達(dá)[8]。miRNA幾乎參與了人類所有的生理和病理過程,如細(xì)胞分化和增殖、代謝、炎癥、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫、腫瘤發(fā)生等;miRNA越來越被認(rèn)為是各種疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵分子,并且是疾病診斷或治療的潛在生物標(biāo)志物[9];但miRNA在甘草酸治療大鼠酒精性肝損傷過程的作用機(jī)制并不明確。為進(jìn)一步明確甘草酸在治療大鼠酒精性肝損傷過程中miRNA的潛在作用機(jī)制及作用靶點(diǎn),通過甘草酸灌胃治療酒精性肝損傷,并使用miRNA芯片對(duì)肝組織檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)甘草酸組較模型組存在13個(gè)差異miRNA,說明miRNA在甘草酸治療大鼠酒精性肝損傷過程中有著重要作用,是甘草酸引起的多個(gè)miRNA異常表達(dá)或失活的復(fù)雜生物學(xué)過程。

差異表達(dá)miRNA中的miR-107已證實(shí)在ALD患者肝臟中miR-107表達(dá)增加,但在健康肝臟或病毒性肝炎受試者中卻沒有增加[10];在甘草酸組中miR-107表達(dá)下降,提示甘草酸可使miR-107表達(dá)恢復(fù),進(jìn)而保護(hù)肝臟損傷。乙醇和LPS可以使let-7表達(dá)下調(diào)進(jìn)而激活肝星狀細(xì)胞,而肝星狀細(xì)胞在肝纖維化發(fā)展中起著重要作用,該研究表明甘草酸可以使let-7表達(dá)上調(diào)。miR-181-3p通過調(diào)控通過TLR4-NF-κB途徑的信號(hào)傳導(dǎo),增加脂多糖敏感性,進(jìn)而調(diào)控酒精對(duì)小鼠的肝損傷[11]。miR-122也已經(jīng)被證實(shí)與酒精性肝損傷、肝纖維化的進(jìn)展有著密切聯(lián)系[12]。miR-291b可以通過調(diào)控靶標(biāo)Tollip抑制NF-κB信號(hào)通路,導(dǎo)致更多的肝臟炎癥[13]。miR-615已被證實(shí)在肝癌、惡性膠質(zhì)瘤、淋巴瘤等多種腫瘤組織找那個(gè)異常表達(dá),與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等存在密切關(guān)系[14]。這些miRNA在甘草酸治療酒精性肝損傷過程發(fā)生變化,說明他們?cè)诟什菟嶂委熅凭愿螕p傷過程中發(fā)揮著重要作用。

GO富集分析顯示,差異miRNA主要與細(xì)胞黏附、抗氧化活性、代謝過程、生物過程調(diào)控、細(xì)胞殺傷、免疫系統(tǒng)等功能相關(guān)。乙醇可以增加活性氧的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化,同時(shí)增加肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在ALD發(fā)病和發(fā)展中起著重要作用[15];研究提示甘草酸和這些生物功能相關(guān)。甘草酸治療酒精性肝損傷的過程涉及復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的改變,本研究使用了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)合KEGG信號(hào)通路聯(lián)合分析甘草酸在治療肝損傷過程中miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化,更加清晰展示miRNA-靶基因-信號(hào)通路之間的調(diào)控關(guān)系及程度。從差異miRNA中篩選出了miR-615、miR-107-3p、miR-292-5p關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)miRNA,以及MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras關(guān)鍵信號(hào)通路,提示甘草酸可能是通過這幾個(gè)關(guān)鍵miRNA和信號(hào)通路調(diào)控下游目標(biāo)分子進(jìn)而減輕肝臟損傷。

該研究探討了甘草酸在治療大鼠酒精性肝損傷過程中miRNA表達(dá)譜的變化,以及關(guān)鍵miRNA與信號(hào)通路的篩選,為ALD的靶向治療提供重要的理論依據(jù)。研究提示miR-615、miR-107-3p、miR-292-5p可通過MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras等信號(hào)通路調(diào)控下游靶標(biāo)進(jìn)而減輕酒精性肝損傷,但具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。