實驗性血小板微粒對葡聚糖硫酸鈉結腸炎小鼠腸黏膜通透性的影響

楊 彬,李會會,張路遙,劉秋圓,王迪迪,胡 靜,韓 瑋,劉曉昌,梅 俏

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一種病因和發病機制尚未完全明確的消化道慢性非特異炎癥性疾病,遺傳、環境、感染和免疫等多因素相互作用引起的腸道黏膜免疫異常是IBD發病的重要環節。一般認為,病原相關分子模式和損傷相關分子模式(damage associated molecular pattern, DAMP)是致病因素激發腸道免疫炎癥損傷的重要途徑[1]。血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)能夠表達多種DAMP信號分子、參與機體的炎癥免疫反應。多項研究[2-4]表明,IBD患者外周血PMPs水平顯著升高且與疾病活動程度正相關。IBD患者損傷的腸道組織局部可見大量中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs)形成[5],而抑制NETs形成可以有效減輕結腸炎小鼠的結腸炎癥病變,表明NETs在腸黏膜損傷機制中發揮重要作用[6]。IBD患者高表達的PMPs可通過誘導NETs形成參與引發高凝狀態和血栓形成[7],而系統性硬化癥相關研究中,血小板可通過釋放含有HMGB1的PMPs途徑激活中性粒細胞促進NETs的形成,進而促進疾病進展[8]。但在IBD中,PMPs是否通過誘導NETs的形成促進腸道炎癥以及NETs對腸黏膜通透性的作用尚未見報道。該研究通過對DSS結腸炎小鼠腹腔注射PMPs,觀察NETs的形成情況和結腸炎癥及黏膜通透性的變化,以探討PMPs作用于IBD結腸黏膜的可能機制,為IBD的病理生理機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取6～8周齡、體質量20.0 g±2.0 g的雄性C57BL/6小鼠,購自安徽省動物中心,將所有動物飼養于安徽醫科大學動物實驗中心SPF動物房,保持恒溫恒濕、12 h/12 h光暗周期環境。

1.2 主要試劑和儀器葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)、異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate dextran,FITC-D)和Ⅰ型膠原購自美國Sigma公司;髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、組蛋白H3(citH3)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-10和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司;BCA法微量蛋白檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;枸櫞酸鹽緩沖液、EDTA溶液和改良型臺氏液(modified Tyrode′s buffer, MTB)為實驗室自行配制。MQX200酶標儀購自美國Biotek公司,透射電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.3 PMPs懸液制備采集IBD患者清晨肘靜脈血5 ml,枸櫞酸鈉管抗凝。樣本立即2 000 r/min離心5 min,收集上層富血小板血漿,進一步將富血小板血漿4 000 r/min離心5 min得到血小板沉淀,經枸櫞酸鹽緩沖液洗滌后重懸于MTB中。調整血小板懸液濃度為3×108/ml,加入Ⅰ型膠原(20 mg/ml)激活血小板,30 min后加入EDTA(20 mmol/l)中止活化,隨后2 000 r/min離心5 min(2次)。收集上清液,20 000 r/min離心90 min,得到PMPs沉淀并懸浮于MTB中。BCA法檢測懸液PMPs濃度并稀釋至0.2 μg/ml,-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 動物分組、造模、給藥和觀察小鼠正常飲食7 d適應環境后,通過用5% DSS代替飲用水7 d(從第1天到第7天)誘導實驗性結腸炎。所有小鼠隨機分為4組,每組10只:① 正常對照組(normal control, NC):正常飲水,腹腔注射生理鹽水;② PMPs組:正常飲水,腹腔注射PMPs;③ DSS組:DSS飲水+腹腔注射生理鹽水;④ 實驗組:DSS飲水+腹腔注射PMPs。PMPs每天注射1次(0.1 ml,濃度0.2 μg/ml),對照組注射同體積生理鹽水。末次給藥后麻醉、處死小鼠,收集腸道組織標本。每天定時對各組小鼠進行體質量稱量、觀察大便性狀,并進行糞便隱血檢測等,參照文獻[9]進行疾病活動指數(disease activity index,DAI)統計。取遠端結腸組織用10%甲醛固定,石蠟包埋,HE染色,參照文獻[9]對小鼠結腸進行病理組織學評分(histopathological index,HI)。

1.5 結腸組織勻漿炎癥因子及NETs水平檢測取結腸黏膜組織在冷生理鹽水中勻漿,離心后取上清液,按試劑盒說明進行MPO、NE、citH3與炎癥因子IL-1β、IL-10和TNF-α含量的測定,相對熒光定量法用于檢測游離DNA含量。

1.6 腸黏膜通透性檢測小鼠禁食8 h后,按500 mg/kg對小鼠進行FITC-D(濃度125 mg/ml)灌胃操作,4 h后對小鼠進行水合氯醛腹腔注射麻醉,經門靜脈取血100 μl,立即用1.9 ml Tris液(50 mol/L)稀釋,4 000 r/min離心10 min后取上清液用酶標儀(激發波長480 nm和發射波長530 nm)測定FTIC-D含量[9]。

1.7 腸黏膜超微結構透射電鏡分析將小鼠腸黏膜組織置于預冷的載玻片上,浸入2.5%戊二醛溶液后切成0.5～1 mm2小塊,置于2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定6 h。PBS沖洗,1%四氧化鋨溶液固定,不同濃度乙醇梯度脫水后,置于60 ℃恒溫箱環氧樹脂固化48 h。超薄切片,枸櫞酸鉛染色,漂洗、干燥后使用透射電子顯微鏡觀察腸黏膜組織結構。

2 結果

2.1 PMPs對DSS結腸炎小鼠DAI評分和結腸病理損傷程度的影響NC組小鼠無血便和體質量下降等癥狀,結腸黏膜結構完整、腺體排列整齊、無炎性細胞浸潤(圖1B)。DSS組小鼠表現為體質量減輕,出現稀糊狀大便和肉眼血便,DAI和HI評分較NC組升高(P<0.01,圖2);DSS組小鼠光鏡下可見結腸黏膜水腫增厚,腸黏膜上皮細胞損傷,部分腺體變形,杯狀細胞減少,局部可見大量炎細胞浸潤(圖1B)。以上表明DSS結腸炎小鼠模型構建成功。PMPs組小鼠DAI評分與NC組接近,但HI評分升高(P<0.01,圖2);結腸病理表現為腸黏膜局部水腫,腺體結構輕度變形,杯狀細胞大致正常,局部可見炎細胞浸潤(圖1B);提示PMPs可能具有一定的致炎作用。實驗組小鼠血便等癥狀較DSS組重,DAI和HI評分略高于DSS組,但差異無統計學意義。病理可見結腸黏膜腫脹、腺體結構受損、隱窩變形、炎性細胞廣泛浸潤(圖1B)。上述結果提示,PMPs加重了DSS誘導的結腸炎。

圖1 實驗性結腸炎小鼠體質量及腸黏膜病理改變 A:PMPs對DSS結腸炎小鼠體質量的影響;B:DSS結腸炎小鼠腸黏膜病理損傷HE ×200;1:NC組;2:PMPs組;3:DSS組;4:實驗組

圖2 PMPs對DSS結腸炎小鼠結腸DAI、HI評分的影響A:DAI評分;B:HI評分;與NC組比較:**P<0.01;與DSS組比較:##P<0.01

2.2 PMPs對DSS結腸炎小鼠結腸炎癥因子水平的影響ELISA法檢測小鼠結腸組織勻漿中炎癥因子IL-1β、IL-10及TNF-α的表達水平,結果如圖3所示。相較于NC組,PMPs組、DSS組及實驗組促炎因子IL-1β、TNF-α水平均升高(F=242.226、449.459,P<0.05);其中DSS組與實驗組TNF-α水平差異無統計學意義。

圖3 PMPs對DSS結腸炎小鼠腸黏膜組織炎癥因子表達水平的影響與NC組相比較:*P<0.05;與DSS組相比較:#P<0.05

與NC組相比,PMPs組、DSS模型組及實驗組IL-10均降低(F=104.062,P<0.05);其中DSS組與實驗組IL-10水平差異無統計學意義。DSS模型組小鼠經PMPs干預后, IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05),IL-10水平差異無統計學意義。

2.3 PMPs對DSS結腸炎小鼠結腸NETs水平的影響在共聚焦顯微鏡下無法直接觀察到PMPs誘導DSS結腸炎小鼠形成NETs,故以小鼠結腸黏膜中檢測NETs成分(MPO、NE和citH3)水平來反映NETs的形成。如圖4所示,相較于NC組,DSS組MPO、NE和citH3水平稍增高(P<0.05),游離DNA水平降低(P<0.05);PMPs組MPO、NE 和citH3水平均升高(P<0.05)。與DSS組相比,實驗組小鼠結腸組織MPO、NE和citH3表達水平增加,游離DNA表達水平降低(P<0.05)。結果提示PMPs誘導DSS結腸炎小鼠腸黏膜組織NETs形成。

圖4 PMPs對DSS結腸炎小鼠腸黏膜組織NETs成分表達水平的影響與NC組比較:*P<0.05;與DSS組比較:#P<0.05

2.4 PMPs對DSS結腸炎小鼠腸黏膜通透性的影響如圖5所示,與NC組比較,PMPs組、DSS組和實驗組小鼠血漿FITC-D水平更高(P<0.05);與DSS組比較,實驗組小鼠的血漿FITC-D水平明顯增高(P<0.05)。以上結果提示PMPs可增加小鼠腸黏膜的通透性,可能進一步加重結腸炎癥。

圖5 PMPs對DSS結腸炎小鼠腸黏膜通透性的影響與NC組比較:*P<0.05;與DSS組比較:#P<0.05

進一步使用透射電鏡對小鼠結腸黏膜超微結構進行觀察,如圖6所示。NC組小鼠腸黏膜微絨毛較長,排布緊密有序,細胞間連接結構完整(圖6A);PMPs組可見腸微絨毛輕度萎縮,局部排列變稀疏,細胞連接結構尚清晰,緊密程度輕度降低(圖6B);DSS組可見結腸微絨毛明顯萎縮甚至缺失,細胞間連接復合體縮短變寬,細胞間隙擴大,部分緊密連接開放(圖6C)。與DSS組相比,實驗組小鼠同樣出現微絨毛萎縮缺失,排列稀疏,細胞間隙增大,但細胞連接結構更加模糊(圖6D)。以上結果提示PMPs可能加重DSS結腸炎小鼠腸黏膜屏障結構的損傷,增加腸黏膜通透性。

圖6 小鼠腸黏膜超微結構圖 ×2 000A:NC組;B:PMPS組;C:DSS組;D:實驗組

3 討論

IBD發病機制尚不十分明確,目前認為腸黏膜屏障損傷和腸道菌群紊亂具有重要作用。腸黏膜通透性增加,細菌和內毒素等致病因素通過病原相關分子模式和DAMP激發免疫反應和炎癥損傷。其中,DAMP多來源于機體組織或細胞損傷釋放的信號分子,通過識別細胞中的PRR受體,誘導炎癥和免疫損傷的發生[10]。研究[8]表明,含有大量DAMP信號的細胞微粒與炎癥免疫損傷過程密切相關。

PMPs是體內含量最高的細胞微粒,除了具有抗凝作用外,還兼具傳遞生物信息、參與炎癥免疫反應的功能。大量研究[11-12]表明,PMPs可以參與血栓形成、觸發炎癥反應,在糖尿病、心血管疾病以及自身免疫性疾病中發揮重要作用。IBD發病常伴血小板增多,既往研究提示IBD患者存在PMPs表達上調[13],研究[4]結果顯示IBD患者循環和腸組織中PMPs的表達水平均與疾病活動程度正相關,且PMPs能夠在體外誘導中性粒細胞形成NETs,這些結果提示PMPs可能通過誘導NETs形成參與腸道炎癥活動。

NETs是由活化的中性粒細胞釋放的纖維網絡狀結構,含有NE、組蛋白H3、抗菌蛋白等高效抗菌成分,在糖尿病、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病和癌癥等疾病過程中均發揮重要作用[14]。在IBD活動期,患者體內PMPs水平升高,并通過與中性粒細胞作用形成NETs,加重結腸組織損傷,觸發血栓形成[7, 15]。本研究在構建DSS結腸炎小鼠的基礎上,通過PMPs腹腔注射,發現PMPs可以加重小鼠的結腸炎癥。通過電鏡和FITC-D檢測,發現PMPs干預后小鼠腸上皮細胞損傷加重,表現為炎細胞廣泛浸潤、腺體破壞、細胞間連接疏松,腸黏膜通透性增加。本研究未能在結腸免疫熒光實驗中直接觀察到NETs形成,推測可能是由于NETs具有不穩定性和易分解性,腸道蠕動導致NETs清除速度較快,以及DSS結腸炎模型中結腸隱窩膿腫數量不足等原因。但實驗組在注射PMPs后結腸黏膜組織勻漿MPO、NE及citH3等NETs成分含量的明顯增加,間接反映小鼠結腸黏膜中NETs的形成,表明PMPs能夠誘導NETs形成,增加DSS結腸炎小鼠的腸黏膜通透性。

該研究表明,PMPs可在小鼠體內誘導NETs形成,增加DSS結腸炎小鼠的腸黏膜通透性。但有關NETs對腸屏障功能的影響機制研究尚不深入,可能與其對腸上皮細胞的直接毒性作用和抑制炎癥因子釋放有關;PMPs如何與中性粒細胞相互作用誘導NETs形成、進而影響腸道黏膜免疫,仍需進一步研究。