KCTD7基因在肝細胞癌中的表達和作用機制

趙 雅,趙 楠,趙 薇,喻文穎,房 曉

肝癌是中國常見的腫瘤之一,侵襲性強、預后較差,是病死率僅次于胃癌的惡性腫瘤[1-2]。肝癌的誘因較多,主要由過量飲酒、乙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素攝入等導致[1]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原發性肝癌的95%,是最常見的肝癌類型[2]。手術切除作為非移植治療方法效果較好,但仍有70%的患者在術后5年內復發[2]。HCC的發病機制目前尚未研究透徹,因此,進一步明確HCC發生發展的作用機制對于提高肝癌早期診斷率、尋找治療靶點、改善預后至關重要。

鉀離子通道四聚體結構域7(potassium channel tetramerization domain containing 7,KCTD7)是KCTD蛋白家族的成員之一,包含一個與電壓門控鉀離子通道中T1結構域類似的氨基末端結構域[3]。已有研究[3]表明KCTD7基因突變可能是通過調節谷氨酰胺轉運體SAT2使神經元功能受損進而影響多種疾病發生發展,如進行性肌陣攣癲癇及神經元蠟樣脂褐質沉積癥等。但目前,KCTD7與腫瘤相關的研究尚未見報道。該研究運用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數據庫探索KCTD7在HCC中的表達及其對預后生存的影響,為臨床研究提供新線索。

1 材料與方法

1.1 數據來源從TCGA數據庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/)中獲取HCC患者的mRNA表達譜及年齡、性別、生存信息及臨床分期等臨床數據,共有369例患者參與此次研究,樣本中50例肝癌組織樣本有配對的正常組織樣本。

1.2 表達差異與預后分析通過Wilcoxon檢驗比較肝癌組織和正常組織、50例配對肝癌組織及其正常組織中KCTD7的表達情況,分析KCTD7基因與HCC患者年齡、性別及臨床分期之間的關系。使用R軟件包ggplot2和ggpubr進行繪圖和統計學分析[4]。運用R軟件包survival和survminer通過中位數分組和算法優化分組兩種分組方法分析KCTD7與HCC患者總生存期(overall survival)之間的關系[4]。采用單因素和多因素Cox回歸分析,研究KCTD7基因、患者年齡、性別及臨床分期與患者預后間的關系,使用R軟件包forestplot繪制森林圖[4]。

1.3 基因富集分析及免疫浸潤分析為探究KCTD7基因的潛在功能,對基因按照與KCTD7表達的相關性(Spearman方法)排序后使用R軟件包clusterProfiler[5]通過分子標簽數據庫(Molecular Signatures Database)的基因集進行基因富集分析(GSEA)[6],并用R軟件包enrichplot繪圖。為探究KCTD7對免疫微環境的影響,根據之前報道的28種免疫細胞的免疫浸潤特征基因表達譜,使用R軟件包GSVA[7]通過單樣本基因富集分析(ssGSEA)比較低表達組(表達量最低的10%樣本)和高表達組(表達量最高的10%樣本)的免疫浸潤情況,并使用R軟件包ggplot2和ggpubr繪圖并進行統計分析[4]。

1.4 細胞培養和細胞系構建Lenti-X 293T、Hep3B和HepG2細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。使用Tet-on誘導表達系統,建立可以使用鹽酸強力霉素(Doxycycline,Dox)誘導對照siRNA(siNC)和KCTD7敲低siRNA(siKCTD7)表達的Hep3B、HepG2細胞株。

1.5 細胞增殖檢測將Dox誘導72 h的Hep3B、HepG2對照組和KCTD7敲低細胞均按1×104個/ml接種于12孔板中。每種細胞的對照組和敲低組每天設置3個復孔。每隔24 h分別對孔板中兩組細胞的3個復孔進行臺盼藍染色計數,連續計數5 d并繪制生長曲線。

1.6 Western blot離心收集Dox誘導72 h的Hep3B、HepG2對照組和KCTD7敲低細胞,并用尿素超聲裂解。SDS-PAGE膠電泳分離蛋白,并將蛋白質轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉30 min后,室溫下與TUBULIN(1 ∶80 000;諾唯贊)、CDK6(1 ∶7 500;Proteintech;14052-1-AP)、P21(1 ∶1 000;Proteintech;10355-1-AP)、Cleaved PARP1(1 ∶1 000;HUABIO;ET1608-10)抗體孵育90 min,TBST洗滌3次,用辣根過氧化物酶偶聯的抗兔二抗(1 ∶50 000;HUABIO;HP0112)或抗鼠二抗(1 ∶40 000;CWBIO;CW0102S)室溫孵育60 min。最后用TBST洗滌3次后,使用ECL化學發光試劑盒(諾唯贊,E412)顯影。使用Image J進行灰度分析。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期將Dox誘導72 h的Hep3B、HepG2對照組和KCTD7敲低細胞離心收集在離心管中,用約5 ml 70%無水乙醇重懸并置于-20 ℃固定過夜。離心后再用PBS洗滌一次,加入1 ml含0.1% Triton X-100的PBS孵育15 min。再次離心后棄上清液,加入1 ml PI染液(含0.04 mg/ml PI,0.5 μg/ml RNase的PBS溶液)室溫孵育30 min。使用流式細胞儀計數20 000個細胞并用Modfit軟件分析數據。

1.8 Caspase 3酶活性檢測收取1×106個Dox誘導72 h的Hep3B、HepG2對照組和KCTD7敲低細胞,使用Caspase 3活性檢測試劑盒(上海碧云天公司,C1115)冰浴裂解,離心收集上清液檢測蛋白濃度及Caspase 3活性。按試劑盒說明于37 ℃孵育8 h,通過測定在405 nm處的吸光度除以蛋白濃度計算Caspase 3的相對活性。

1.9 統計學處理使用SPSS 27.0和GraphPad Prism 9軟件進行統計學分析并作圖,所有數據均來自3次獨立重復實驗。單因素樣本兩組間比較采用雙尾t檢驗,多樣本組間均值比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1KCTD7基因在肝癌組織中表達情況根據TCGA數據庫中所得到的369例HCC患者數據進行分析,肝癌組織KCTD7的表達量明顯高于正常組織,差異有統計學意義(W=1 588,P<0.01,圖1A)。對50例肝癌組織及其配對的正常組織進行配對差異表達分析,結果顯示,相較于配對的正常組織,KCTD7在HCC患者的腫瘤組織中表達量升高(V=64,P<0.01,圖1B)。

圖1 KCTD7在肝癌組織和正常組織中的表達水平及其與臨床數據之間的相關性A:TCGA數據庫HCC患者肝癌組織與正常組織中KCTD7的差異表達;與正常組比較:**P<0.01;B:肝癌組織及其配對的正常組織中KCTD7的差異表達;與配對的正常組織比較:##P<0.01;C:不同性別的HCC患者中KCTD7的差異表達;與男性組比較:&&P<0.01;D:不同HCC臨床分期患者中KCTD7的差異表達;與Ⅰ期比較:△△P<0.01

將KCTD7與患者臨床信息組合分析,KCTD7的表達與HCC患者年齡無明顯相關性,但女性HCC患者中KCTD7的表達量相較于男性更高,且差異有統計學意義(W=11 696,P<0.01,圖1C)。在臨床分期上,Ⅲ期樣本中KCTD7的表達量較Ⅰ期更高(W=5 586.5,P=0.004,圖1D)。上述結果提示KCTD7在肝癌組織中高表達,且KCTD7的表達與性別及臨床分期相關。

2.2KCTD7高表達的HCC患者預后比較對TCGA數據庫中獲取的HCC患者KCTD7表達水平和總體生存期進行生存概率分析,結果表明,與KCTD7低表達組相比,高表達組的生存時間減少(χ2=5.071,P=0.024,圖2A)。通過軟件按算法優化分組計算結果也表明KCTD7高表達組預后較差(χ2=12.425,P<0.01,圖2B)。單因素Cox回歸模型表明KCTD7高表達組患者的總體生存期顯著縮短(HR=1.26,95%CI為1.04～1.52,P=0.016,表1)。多因素Cox回歸分析也同時證實了KCTD7的高表達對患者預后的不良影響(HR=1.22,95%CI為1.01～1.48,P=0.041,表2)。上述分析結果提示KCTD7的表達對HCC患者的預后具有潛在的指示價值。

表1 單因素Cox回歸分析

表2 多因素Cox回歸分析

圖2 KCTD7與HCC患者預后分析A:運用中位數分組分析KCTD7表達高低與HCC患者預后生存的關系;與KCTD7高表達組比較:*P<0.05;B:運用算法優化分組分析KCTD7表達高低與HCC患者預后生存的關系;與高風險組比較:#P<0.01

2.3KCTD7對HCC細胞增殖的影響為探究KCTD7基因對HCC的作用,在HCC細胞Hep3B和HepG2中敲低KCTD7。運用活細胞計數法連續計數5 d并繪制生長曲線,結果顯示,與siNC組比較,敲低了內源KCTD7表達的Hep3B細胞和HepG2細胞的siKCTD7組的增殖速度均下降,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。結果表明KCTD7能夠促進HCC細胞增殖。

圖3 敲低KCTD7對HCC細胞增殖的影響A:活細胞計數法分析KCTD7敲低對Hep3B細胞增殖的影響;B:活細胞計數法分析KCTD7敲低對HepG2細胞增殖的影響;與siNC組比較:**P<0.01

2.4KCTD7對HCC細胞周期分布的影響為研究KCTD7基因影響HCC增殖的潛在機制,運用GSEA分析KCTD7基因的潛在調控信號通路。結果顯示,KCTD7高表達與多條細胞增殖信號通路正相關:如G2M檢查點調控通路、有絲分裂紡錘體調控通路等。這些結果提示,KCTD7可能是通過上述通路影響HCC細胞增殖從而發揮促進HCC生長的作用。為驗證上述可能性,分別構建了對照組和KCTD7敲低組的Hep3B和HepG2細胞系,運用流式細胞術檢測了它們的細胞周期分布情況,結果顯示,敲低KCTD7后,兩株HCC細胞系的細胞周期分布均發生了改變(tHep3B-G0/G1=26.78,P=0.001 4;tHepG2-G0/G1=11.81,P=0.007 1,圖4A～D)。進一步運用Western blot方法檢測了細胞周期蛋白的表達情況,在兩株HCC細胞系中,敲低KCTD7基因均能導致細胞周期相關蛋白CDK6表達量下降(t=13.07,P<0.01,圖4E)、P21表達量上升(t=6.635,P=0.005,圖4F)。

圖4 敲低KCTD7對HCC細胞周期的影響A:流式細胞術分析Hep3B細胞的細胞周期(G0/G1、G2/M);B:Hep3B細胞中細胞周期分布情況;C:流式細胞術分析HepG2細胞的細胞周期(G0/G1、G2/M);D:HepG2細胞中細胞周期分布情況;E:Western blot檢測Hep3B和HepG2細胞中CDK6蛋白表達情況;1:Hep3B;2:HepG2;3:直方圖比較;F:Western blot檢測Hep3B和HepG2細胞中P21蛋白表達情況;與siNC組比較:**P<0.01

2.5KCTD7對HCC細胞凋亡的影響分析CCLE數據庫中癌癥細胞系的基因表達情況,Hep3B內源的KCTD7表達量較HepG2高,推測敲低Hep3B中的KCTD7后,其腫瘤細胞生物學效應可能更明顯,因此,以Hep3B細胞為代表,進一步進行了凋亡相關指標的檢測。對對照組和KCTD7敲低的Hep3B細胞中的Caspase 3酶活進行檢測,發現敲低KCTD7基因后,細胞中Caspase 3活性升高(t=87.67,P<0.01,圖5A)。又運用Western blot檢測了上述細胞中的Cleaved PARP1蛋白的表達情況,發現敲低KCTD7后,Cleaved PARP1的蛋白條帶由對照組中不可見轉變為顯著可見(圖5B)。綜上,兩項實驗均提示在Hep3B細胞中敲低KCTD7能夠促進細胞凋亡。

圖5 敲低KCTD7對Hep3B細胞凋亡的影響A:Caspase 3活性分析檢測Hep3B細胞中Caspase 3的酶活力;B:Western blot檢測Hep3B細胞中Cleaved PARP1蛋白表達情況;與siNC組比較:**P<0.01

2.6KCTD7在肝癌中的免疫浸潤情況為探究KCTD7對免疫微環境的影響,通過28種免疫細胞的免疫基因表達圖譜,對KCTD7高表達組和低表達組進行ssGSEA方法分析。結果顯示,與KCTD7低表達組相比,高表達組免疫浸潤情況出現明顯變化,如激活的CD4+T細胞(W=1 085,P<0.01)、中樞記憶CD4+T細胞(W=1 156,P<0.01)、自然殺傷細胞(NK細胞)(W=971,P=0.009)及2型輔助T細胞(Th2)(W=1 101,P<0.01)的豐度上調,而激活的CD8+T細胞(W=378,P<0.01)、CD56自然殺傷細胞(W=429,P=0.002)、嗜酸粒細胞(W=246,P<0.01)、中性粒細胞(W=413,P=0.001)、1型輔助T細胞(Th1)(W=465,P=0.007)及17型輔助T細胞(Th17)(W=427,P=0.002)的豐度下調(圖6)。這些免疫細胞的變化表明,KCTD7對免疫微環境產生干擾可能是導致HCC患者預后較差的一個原因。

圖6 KCTD7低表達組和高表達組中HCC腫瘤的免疫浸潤情況與KCTD7低表達組比較:*P<0.05,**P<0.01

3 討論

本研究通過生物信息學方法初步探索了KCTD7基因在肝癌組織中的表達水平及其預后生存情況。結果顯示,KCTD7在肝癌組織中高表達,且KCTD7表達水平是影響HCC患者總生存期的獨立危險因素。GSEA提示KCTD7可能與細胞周期通路相關,于是本研究構建了兩種穩定敲低KCTD7的HCC細胞系,結合活細胞計數、流式細胞分析、Western blot等多種技術手段,在體外驗證了KCTD7主要通過影響細胞周期分布而調控HCC細胞的增殖。

腫瘤免疫微環境是指由腫瘤細胞周圍的一些免疫細胞、血管、細胞外基質等組成的微環境。在免疫細胞中,CD8+T細胞是抗腫瘤免疫反應中強大的效應細胞。CD8+T細胞可以通過其T細胞受體(T cell receptor,TCR)與癌細胞表達的MHC肽復合物結合來特異性識別癌細胞[8]。TCR參與后,CD8+T細胞通過顆粒酶和穿孔素介導的細胞凋亡或通過FASL-FAS介導的細胞死亡來破壞靶細胞[8]。CD4+T細胞的Th1亞型通過幫助抗腫瘤細胞毒性CD8+細胞和B細胞以及通過產生干擾素-γ(IFN-γ)和TNF-α直接殺死癌細胞來發揮抗腫瘤發生功能[8]。另一方面,Th2亞型可分泌具有促腫瘤功能的抗炎介質[8]。嗜酸粒細胞具有通過釋放細胞毒性分子直接殺死腫瘤細胞的能力,但嗜酸性粒細胞還可以調節腫瘤脈管系統并調節TME的免疫成分,因此,它們可以同時具有促腫瘤和抗腫瘤發生的功能,具體取決于他們收到的激活信號[8]。NK細胞是具有細胞毒性的先天性淋巴樣細胞。它們識別并殺死缺乏MHC I類表達的應激細胞,具有強大的抗癌能力[8]。ssGSEA結果提示,KCTD7能夠對腫瘤免疫微環境產生干擾進而影響HCC細胞生長及患者的預后。

既往研究表明,部分KCTD家族成員與神經性及心血管疾病有一定關聯,如KCTD8和KCTD12通過促進膽堿能神經元中GABAB受體的軸突表達和突觸前興奮影響大腦功能[9]、KCTD10可能通過改變漢族血漿HDL-C水平導致冠心病易感性[10]。但目前KCTD家族與腫瘤相關的研究甚少,如在肺癌中KCTD11通過與β-catenin結合,調節Wnt和Hippo通路的活性,從而抑制腫瘤的進展[11]、在黑色素瘤中通過抑制KCTD12的表達增強細胞的干性進而促進黑色素瘤細胞的生長[12]。而KCTD7與癌癥相關的研究未見報道。本研究探討了KCTD7對HCC發生發展的作用,研究中發現KCTD7基因的表達在GSEA中富集到了Wnt/β-Catenin信號通路,這與KCTD11調控肺癌的信號通路一致,提示KCTD家族各成員對腫瘤的影響可能具有相關性。此外,GSEA結果表明KCTD7參與了多種生長調控通路,如G2/M檢查點調控通路、有絲分裂調控通路等,這提示KCTD7對HCC的影響可能是通過影響其細胞生長及細胞周期導致。

綜上所述,該研究運用TCGA數據庫通過生物信息學分析,發現KCTD7基因高表達對HCC的預后較差,并通過實驗驗證敲低KCTD7基因后能夠影響細胞周期,進一步抑制HCC細胞的增殖,促進細胞凋亡。研究為后續HCC的臨床治療提供了可能的新思路。