哺乳動物細胞ACBD3敲低對鐵死亡的影響

邱 榮, 馬山川, 錢 影,曹新旺

鐵死亡是一種可調控細胞死亡形式,與發育、衰老、免疫和癌癥等生理病理過程密切相關[1]。鐵死亡是由組成細胞膜的多不飽和脂肪酸在鐵離子和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的作用下生成脂質過氧化物,這種脂質過氧化物的積累將破壞細胞膜的完整性,進而導致鐵死亡的發生。因此,鐵死亡是脂質過氧化反應驅動,細胞內氧化還原穩態失衡的結果[2]。迄今為止,文獻中報道的誘導細胞發生鐵死亡的方式包括:抑制抗氧化系統XC-;抑制/降解/失活谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4);消耗還原型輔酶Q10;過氧化物、鐵或多不飽和脂肪酸過載等方式[2]。鐵死亡除了可導致細胞死亡外,在一定程度上還可以消除機體內癌細胞、炎癥細胞或活化的成纖維細胞,因此,闡明鐵死亡發生的分子機制具有重要意義[3]。

ACBD3是一個含有酰基輔酶A結合結構域的高爾基體蛋白,又名PAP7 或GCP60,在進化上非常保守,廣泛表達于人體多種組織。ACBD3在細胞內參與多種生理病理過程,如類固醇合成、脂代謝、高爾基體形態維持、葡糖神經酰胺運輸、病毒入侵、細菌增殖以及腫瘤發生發展等[4]。此外,ACBD3亦可通過與鐵離子轉運蛋白DMT1相互作用維持細胞內鐵穩態[5]。鐵離子過載可導致鐵死亡的發生,而ACBD3蛋白又參與鐵穩態的調控。該研究通過RNA干擾技術降低細胞內ACBD3表達水平,研究其在細胞鐵死亡過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料HeLa細胞和HEK293細胞購自中國科學院細胞庫(上海);胎牛血清、DMEM培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA、嘌呤霉素及Lipofectamin 2000購自美國ThermoFisher公司; ACBD3和β-actin抗體購自武漢Proteintech公司;鐵含量檢測試劑FerroOrange(F374)和Calcein-AM(C326)和耐光型ROS探針(R253)購自上海同仁化學公司;鐵死亡誘導劑RSL3購自美國MCE公司;細胞活力測量試劑盒(g7570)購自美國Promega公司;脂質過氧化檢測試劑BODIPY 581/591 C11購自美國Invitrogen公司;化學發光成像系統購自上海天能公司;激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM800)購自德國蔡司公司;酶標儀(Spark)購自瑞士帝肯公司。

1.2 細胞培養HeLa細胞和HEK293細胞培養在含10%FBS和100 μg/ml的青鏈霉素的DMEM培養基中,設定培養溫度為37 ℃,CO2含量為5%。

1.3 構建ACBD3敲低細胞株根據標準設計程序,尋找兩條長度為21 bp的人源ACBD3最優靶標序列5′-GCAAAGCATTTCATCCAACTT-3′和5′-CCCAGCTCATAGGTGTTCATA-3′。根據載體pLKO.1 puro(Addgene#8453)雙酶切位點來為靶標序列添加酶切接頭,然后按照標準的分子克隆方法,將寡核苷酸退火后克隆到載體pLKO.1 puro。進一步將測序正確的質粒與慢病毒包裝質粒pMD2.G(Addgene# 12259)以及psPax2(Addgene# 12260)一起共轉到HEK293細胞,48 h后收集病毒上清液,用來感染密度為30%～50%的HeLa細胞,感染48 h后用濃度為0.5 μg/ml的嘌呤霉素進行篩選,最終得到ACBD3 敲低的穩定細胞株。ACBD3-shRNA1:(F)C CGGGCAAAGCATTTCATCCAACTTCTCGAGAAGTTG GATGAAATGCTTTGCTTTTTG;(R)AATTCAAAAAG CAAAGCATTTCATCCAACTTCTCGAGAAGTTGGATG AAATGCTTTGC;ACBD3-shRNA2:(F)CCGGCCCAT GAAGAAGGATCATATCCTCGAGGATATGATCCTTCT TCATGGGTTTTTG,(R)AATTCAAA-AACCCATGAA GAAGGATCATATCCTCGAGGATATGATCCTTCTTCA TGGG。

將以上細胞分別分為3組:野生型Hela細胞為對照組;使用shRNA1序列的敲低細胞為ACBD3 sh1組;使用shRNA2序列的敲低細胞為ACBD3 sh2組。

1.4 Western blot檢測將3組細胞分別用PBS洗1次,然后用含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液(pH 7.4的50 mmol/L Hepes, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 1%Triton X-100)在冰上裂解30 min,接著進行SDS-PAGE電泳,轉移到PVDF膜上,用相應的一抗和二抗進行孵育,將PVDF膜放在化學發光成像系統中成像,檢測目標蛋白條帶。

1.5 細胞活力測定在96孔板中分別接種3組細胞 (密度為6×104個/ml),培養過夜。第2天按照40、16、6.4、2.56、1.024 μmol/L共5個濃度梯度加入RSL3,培養24 h后,除去培養基,加入50 μl不含FBS的DMEM,再加入50 μl CellTiter-Glo工作液,避光混勻5 min后,靜置5 min,然后用酶標儀測定化學發光值。

1.6 細胞ROS檢測在96孔板中接種3組細胞(密度為1×105個/ml),培養過夜,次日除去培養基,用HBSS清洗2次,加入高度敏感的DCFH-DA染料工作液,在培養箱培養30 min后,移去工作液,用HBSS清洗2次,再加入HBSS,然后用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.7 細胞中脂質過氧化物檢測將密度為1×105細胞/ml 的3組細胞接種于96孔板中,培養過夜,根據實驗設計進一步分成6組,分別為野生型細胞、ACBD3 sh1、ACBD3 sh2、野生型細胞+RSL3、ACBD3 sh1+RSL3、ACBD3 sh2+RSL3。次日除去培養基,加入或不加入DMEM 培養基稀釋的10 μmol/L RSL3溶液,培養1 h后,清洗細胞2次,添加 BODIPY 581/591 C11工作液,在培養箱內培養30 min后移去培養基,用HBSS清洗細胞2次后,再次加入HBSS,用激光共聚焦顯微鏡成像。

1.8 細胞游離Fe2+含量測定接種3組細胞于96孔板中,在培養箱中培養過夜,第2天先棄去培養基,再用HBSS溶液洗滌細胞3次,然后加入濃度為1 μmol/L的FerroOrange工作液,在培養箱中培養30 min后,無需清洗,直接用熒光顯微鏡下對細胞進行觀察。

1.9 測定細胞內總鐵含量在96孔板中接種3組細胞,培養箱中過夜培養,第2天,移去培養基,用PBS清洗細胞2～3次,每孔加入100 μl濃度為2 μmol/L的Calcein-AM溶液,在培養箱培養15～30 min后棄去培養基,用PBS洗滌細胞2次,后加入HBSS溶液,用熒光顯微鏡觀察細胞。

2 結果

2.1 ABCD3敲低對鐵死亡誘導劑RSL3作用下細胞活力的影響Western blot分析顯示,與對照組細胞相比,用兩種含有不同ACBD3 shRNA病毒處理的細胞中ACBD3表達水平降低(P<0.001)。細胞活力分析實驗顯示,與野生型細胞(對照組)相比,ACBD3敲低組細胞對鐵死亡誘導劑RSL3更為敏感,在RSL3濃度為2.56 μmol/L時細胞活力即已下降了90%,細胞活力降低(F=32.231,P<0.001);而野生型細胞在RSL3濃度達到16 μmol/L時細胞活力才明顯下降(P<0.001)。兩個ACBD3敲低組細胞在不同RSL3濃度下的細胞活力無明顯差異。見圖1。

圖1 RSL3作用下野生型細胞和ACBD3敲低組細胞細胞活力比較A:Western blot檢測對照組和ACBD3敲低組細胞中ACBD3的表達水平;a:對照組;b:ACBD3 sh1組;c:ACBD3 sh2組;B:不同給藥濃度下的細胞活力;與RSL3同一給藥濃度敲低組比較:***P<0.001;與6.4 μmol/L RSL3濃度下的對照組比較: ###P<0.001

2.2 ACBD3敲低對細胞脂質過氧化水平的影響在野生型細胞和ACBD3敲低組細胞中,分別不加入或加入10 μmol/L RSL3,然后利用BODIPY 581/591 C11檢測細胞脂質過氧化。BODIPY 581/591 C11探針分子通過與脂質過氧化時產生的脂質自由基反應檢測細胞脂質過氧化水平。未發生反應的探針發出紅色熒光,而發生反應后的探針由紅色變為綠色,因此,可以利用相對熒光強度(綠色/紅色)來表征細胞內脂質過氧化水平改變。結果顯示,與野生型細胞相比,ACBD3敲低組細胞脂質過氧化增加(F=25.261,P<0.001)。RSL3處理后,相應組細胞相對熒光強度增強(F=30.337,P<0.001);與野生型細胞相比,ACBD3敲低組細胞的脂質過氧化水平增加(F=28.732,P<0.001)。兩不同ACBD3敲低組細胞在RSL3不存在或存在條件下脂質過氧化水平無明顯差異。見圖2。

圖2 BODIPY 581/591 C11標記野生型細胞和敲低組細胞脂質過氧化水平比較A～C:野生型細胞、ACBD3 sh1細胞、ACBD3 sh2細胞的熒光圖像 ×40;1:未使用RSL3處理的綠色熒光圖像;2:未使用RSL3處理的紅色熒光圖像;3:RSL3處理的綠色熒光圖像;4:RSL3處理的紅色熒光圖像;D:各組細胞相對熒光強度統計學分析;a:野生型細胞;b:ACBD3 sh1;c:ACBD3 sh2;d:野生型細胞+RSL3;e:ACBD3 sh1+RSL3;f:ACBD3 sh2+RSL3;與野生型細胞比較:***P<0.001;與野生型細胞+RSL3比較:###P<0.001

2.3 ACBD3敲低對細胞內ROS濃度的影響利用耐光性ROS探針檢測野生型細胞和ACBD3敲低組細胞ROS水平。結果表明,與野生型細胞相比,ACBD3敲低組細胞中ROS水平升高(F=33.261,P<0.001),而兩個ACBD3敲低組細胞ROS濃度無明顯差異。見圖3。

圖3 ROS探針標記野生型細胞和ACBD3敲低組細胞ROS水平比較A: ROS探針標記野生型細胞和ACBD3敲低組細胞 ×40;B:各組細胞熒光強度統計學分析;1:對照組;2:ACBD3 sh1組;3:ACBD3 sh2組;與對照組比較:***P<0.001

2.4 ACBD3敲低對細胞內總鐵含量和Fe2+水平的影響利用熒光探針Calcein-AM測量細胞中的總鐵含量,該探針螯合細胞中鐵離子后其熒光將會淬滅。因此,Calcein-AM標記細胞的熒光強度與細胞中總鐵含量呈負相關。測量結果表明,與對照組比較,ACBD3敲低組細胞熒光強度增強(F=19.205,P<0.001),但兩個ACBD3敲低組細胞間熒光強度差異無統計學意義。因此,與對照組細胞相比,ACBD3敲低組細胞內總鐵含量明顯下降。

利用FerroOrange探針檢測細胞內Fe2+濃度,該探針結合細胞內Fe2+后熒光強度會隨鐵離子濃度增加。結果顯示,與對照組細胞相比,ACBD3敲低組細胞中熒光強度增強(F=26.379,P<0.001),但兩個ACBD3敲低組細胞間熒光強度差異無統計學意義。因此,與對照組細胞相比,ACBD3敲低組細胞Fe2+濃度升高。見圖4。

圖4 野生型細胞與ACBD3敲低組細胞內總鐵含量和Fe2+水平比較A:Calcein-AM探針標記對照組和ACBD3敲低組細胞 ×40;B:各組細胞內總鐵含量統計學分析;C:FerroOrange探針標記對照組和ACBD3敲低組細胞 ×40;D:各組細胞內Fe2+含量統計學分析;1:對照組;2:ACBD3 sh1組;3:ACBD3 sh2組;與對照組比較:***P<0.001

3 討論

鐵死亡是一種鐵依賴的細胞膜氧化損傷進而引發的調節性細胞死亡,與細胞凋亡、壞死和細胞自噬存在較大區別[6]。近年來,多項研究[7-8]表明,鐵死亡在腫瘤抑制以及某些癌癥治療過程中發揮重要作用,因此,靶向誘導鐵死亡已成為腫瘤研究熱點之一。

細胞膜中含有大量磷脂分子,它們由單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸組成。在ROS和鐵離子存在的條件下,多不飽和脂肪酸可被氧化產生脂質過氧化物,從而引起細胞膜破損,導致細胞鐵死亡[1]。在生理條件下,細胞可利用自身的抗氧化系統進行調控,避免細胞膜損傷。因此,測定脂質過氧化物是研究細胞鐵死亡的一個重要標準。本研究中,ACBD3敲低組細胞顯著增加了對鐵死亡誘導劑RSL3的敏感性,在RSL3濃度為2.56 μmol/L時細胞活力顯著下降。進一步實驗結果表明,ACBD3敲低可使細胞內ROS水平提高、脂質過氧化水平明顯增加。

維持細胞鐵穩態是細胞進行正常生理功能的必要條件,破壞鐵穩態將導致機體發生多種病變[9]。例如,鐵過載引發的鐵死亡在多種心血管疾病發展過程中有重要作用[10]。Cheah et al[5]報道,ACBD3可與鐵離子轉運蛋白DMT1相互作用,它們與Ras超家族G蛋白Dexras1一起,維持細胞內鐵離子穩態。鐵離子的存在是發生鐵死亡不可或缺的條件。實驗結果表明,ACBD3敲低導致的細胞內Fe2+濃度顯著提高,進一步證實敲低ACBD3促進了細胞鐵死亡過程,但是,ACBD3敲低導致的細胞內Fe2+濃度升高的的分子機制仍需進一步研究。

ACBD3在亨廷頓舞蹈癥等神經退行性疾病患者以及乳腺癌等腫瘤患者中表達量均顯著上調[11-12]。神經退行性疾病患者的中樞神經系統及周圍神經系統的特定區域可發生明顯的細胞鐵死亡現象。鐵死亡在腫瘤的放射治療過程中亦具有重要作用[13]。因此,闡明ACBD3在鐵死亡過程中的作用機制,合理干預細胞鐵死亡進程,可為相關疾病的診療提供重要解決方案。