TLR7通過NF-κB炎癥通路調控ION-CCI模型大鼠三叉神經痛的機制

張宏偉,沈 蓮,吳貝貝,王元銀,王烈成

三叉神經痛(trigeminal neuralgia,TN)是發(fā)生在三叉神經分布區(qū)可引起劇烈的面部疼痛。卡馬西平作為TN的一線藥物治療[1-2],長期使用具有藥物依賴性和相關并發(fā)癥的發(fā)生[3]。因此,需要對這種病理機制不明且痛感強烈的疾病有更好的治療方案。Toll樣受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)是Toll樣家族成員之一,通過增加感覺神經元的興奮性參與疼痛和瘙癢[4-5]。TLR7在受損背根神經節(jié)中表達水平升高并促進神經性疼痛[6-7],但TLR7是否參與三叉神經病理性疼痛尚不清楚。有證據[8]表明,核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)在神經性疼痛發(fā)生中起關鍵作用。哺乳動物NF-κB家族由5種轉錄因子組成:p65(也稱為RelA)、RelB、c-Rel、p105/p50和p100/p52,其中RELA(p65)-p50異二聚體最常被檢測到,并且負責最多的轉錄活性[9]。同時,炎癥因子如TNF-α、IL-1β也是產生和維持神經病理性疼痛的原因[10]。

該研究建立大鼠TN模型,通過檢測TLR7、p65、p-p65及炎癥因子(TNF-α、IL-1β)水平的變化驗證TLR7通過激活感覺神經元中的NF-κB而調控神經病理性疼痛。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器Von Frey hair纖毛刺激絲購自美國Stoelting科技有限公司(貨號:N5210);高速低溫組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司(貨號:KZ-Ⅲ-F);實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀購自美國BIO-RAD公司(貨號:9700);PrimeScript RT reagent Kit、TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)購自日本TaKaRa生物科技有限公司;qRT-PCR引物購自上海生工生物工程科技有限公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;TLR-7抑制劑Hydroxychloroquine Sulfate購自上海藍木化工公司 (貨號:NSC 4375);TLR7 Antibody購自美國Affinity Biosciences公司(貨號:DF6173);Phospho-NF-κB p65 Antibody 購自合肥千俞生物科技有限公司(貨號:S536);NF-κB p65 Antibody購自上海磐超生物科技有限公司(貨號:YM3111);TNF-α Antibody購自武漢塞維爾生物科技有限公司(貨號:GB11188);IL-1β Antibody購自北京博奧森生物科技有限公司(貨號:BS-0812R)。

1.2 實驗動物及TN模型的構建

1.2.1實驗動物 選用由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供的成年雄性Sprange-Dawley(SD)大鼠,體質量(180～200)g ,常規(guī)飼料飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度控制在(23～28)℃,12 h/12 h明暗交替光照,自由飲水飲食。動物實驗通過安徽醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(批號:LLSC20190705)。

1.2.2TN模型的構建 選用顴骨下入路眶下神經縮窄術(infraorbital nerve-chronic constriction injury,ION-CCI)建立TN動物模型。為了最大限度地減少行為結果測量的個體內和個體間的變異性,實驗分組前對大鼠適應性訓練一周,剔除對Von Frey纖毛刺激絲反應過于敏感或遲鈍的大鼠。大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛,劑量按每100 g體質量0.35 ml計算。

待大鼠睫毛反射消失后,在左側眶下顴弓和鼻骨結合處、大鼠觸須墊下方作一長約6 mm切口,用血管鉗鈍性分離肌肉周邊筋膜,再用玻璃分針分離眶下神經使其暴露出3 mm左右。手術組(CCI組)大鼠用兩根5-0縫合線結扎眶下神經,結扎線前后間距約2～3 mm。結扎時注意力度適中,使眶下神經受到壓迫直徑略微變細,但未阻斷其傳導及血液循環(huán)為宜。結扎完成后用3-0縫合線縫合皮膚創(chuàng)口。假手術(Sham)組大鼠使用同樣的操作手法,僅暴露眶下神經無需結扎。

1.3 實驗分組

1.3.1TLR7在TN大鼠三叉神經節(jié)(trigeminal ganglion,TG)中的表達 將SD大鼠隨機分成2組,即CCI 組及Sham組,6只/組。采用Von Frey hair 纖毛刺激絲分別測試大鼠術前1、0 d和術后8個時間點(1、3、5、7、9、12、14、16 d)術側觸須墊區(qū)域的機械痛閾,記錄閾值并對大鼠不同時間點的機械痛閾進行統(tǒng)計分析。通過qRT-PCR及免疫印跡法(Western blot)檢測術側三叉神經節(jié)(TG)內TLR7和NF-κB p65、p-p65及炎癥因子(TNF-α、IL-1β)表達變化。

1.3.2抑制TLR7表達后對TN大鼠的影響 將眶下神經損傷后的SD大鼠隨機分成3組,即CCI組、CCI + NS組(CCI +生理鹽水組)及CCI +羥基氯喹(hydroxychloroguine, HCQ)組,6只/組。CCI組造模當天(0 d)開始灌胃給藥,藥物現配現用,連續(xù)14 d,每天給藥1次,劑量為100 mg/kg。使用Von Frey hair纖毛刺激絲進行機械痛閾測定。通過qRT-PCR和Western blot方法對各組大鼠TG中TLR7和NF-κB p65、p-p65及炎癥因子(TNF-α、IL-1β)表達量進行檢測及對比。

1.4 機械痛閾測定和陽性標準判定術后或每次HCQ給藥后4 h,使用Von Frey hair纖毛刺激絲進行機械痛閾測定。每日測定機械痛閾時間為上午10:00—12:00,將大鼠置于安靜環(huán)境中用Von Frey hair纖毛刺激絲刺激大鼠術側觸須墊(刺激強度從小到大依次進行,分別為(0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.40、0.60、1.00、1.40、2.00 g),每根毛刷重復刺激5次,每次刺激間隔時間大于30 s,刺激標準是使纖維細絲剛好彎曲,直到某一毛刷激發(fā)大鼠重復出現陽性反應3次。

動物的陽性行為主要包括:① 快速縮頭、躲避毛刷避開刺激;② 連續(xù)搔抓觸須墊部;③ 快速抓咬毛刷的攻擊行為。此時記錄該毛刷所對應的克數即為機械痛閾。

1.5 qRT-PCR將大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉致死,麻醉劑量以每100 g體質量0.7 ml的比例計算,采集大鼠術側TG,采用Tissue RNA Purification Kit Plus提取mRNA ;PrimeScript TM RT Rea- gent Kit、TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ進行cDNA的合成和PCR的擴增;熒光定量PCR儀檢測TG中TLR7及炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達情況。使用2-ΔΔCt計算其相對表達水平。實驗所用熒光定量 PCR基因引物序列見表1。

千朵明霞萬綠扶，迎風舞遍繡羅襦。 為看國色天香品，喜讀青松紅杏圖。 花好偏教開紺宇，詩清不異飲冰壺。 莫嫌九十韶光老，天付繁華與鼠姑。[4]299

1.6 Western blot以上述同樣方法采集不同組大鼠術側TG組織編號稱重后,每1 mg組織加入含1% PMSF的10 μl RIPA裂解液,置于KZ-Ⅲ-F高速低溫組織研磨儀中研磨。于4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min,吸取上清液并且按照比例加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃加熱10 min使蛋白充分變性,放置于-20 ℃下保存待用。使用10% SDS-PAGE凝膠配制試劑盒制備凝膠,上樣行SDS凝膠電泳后將目的蛋白轉移到PVDF膜上,TBST溶液漂洗3次,每次約10 min后,將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中,室溫下搖床封閉2 h。置于一抗稀釋液中(TLR-7 Antibody 1 ∶3 000;Phospho-NF-κB p65 Antibody 1 ∶3 000; NF-κB p65 Antibody 1 ∶3 000;TNF-α Antibody 1 ∶3 000;IL-1β Antibody 1 ∶3 000)4 ℃下孵育過夜。PVDF膜充分漂洗后置于已稀釋好的二抗中室溫孵育1.2 h。將PVDF膜充分漂洗后放置于顯影機內設置條件曝光成像,最后使用Image J軟件對曝光后的蛋白條帶圖灰度值進行統(tǒng)計分析,檢測TLR7和NF- κB p65 、p-p65及炎癥因子(TNF-α、IL-1β)蛋白的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理應用GraphPad Prism 8.0對數據進行統(tǒng)計分析。機械痛閾測定結果采用雙因素方差分析,CCI組及Sham組兩組間qRT-PCR實驗及Western blot實驗數據比較采用獨立樣本t檢驗,CCI組、CCI+NS組及CCI+HCQ組qRT-PCR實驗和Western blot實驗數據采用單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學實驗結果由Von Frey hair纖毛刺激絲檢測不同組大鼠機械痛閾測定結果顯示:術后3～16 d CCI組大鼠的機械痛閾均低于Sham組大鼠,見圖1。術后3 d CCI組大鼠機械痛閾即開始降低(t=1.581,P<0.05),于造模后14 d疼痛達到最高峰(t=13.572,P<0.001)。CCI組術前及術后0、1 d機械痛閾與Sham組比較,差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 兩組大鼠術側不同時間點機械痛閾的變化與Sham組比較:*P<0.05,***P<0.001

2.2 TLR7、NF-κB p65、p-p65及TNF-α、IL-1β在大鼠術側TG中的表達變化

2.2.1術后TLR7表達量變化 qRT-PCR結果顯示術后第14天CCI組大鼠TG中TLR7 mRNA表達較Sham組升高(t= 6.724,P<0.01),見圖2A。Western blot結果顯示術后第14天CCI組大鼠TG中TLR7蛋白表達較Sham組升高(t= 8.27,P<0.01),見圖2B。

圖2 TLR7在CCI組大鼠術側TG中的表達變化A:TLR7在兩組大鼠術側TG內mRNA表達;B:TLR7在兩組大鼠術側TG內蛋白表達;與Sham組比較:**P<0.01

2.2.2術后p65及p-p65表達量變化 Western blot結果顯示術后第14天CCI組大鼠p65表達量與Sham組相比差異無統(tǒng)計學意義(t=0.533,P>0.05),見圖3A。術后第14天CCI組大鼠TG中p-p65蛋白表達較Sham組升高(t=3.785,P<0.05),見圖3B。

圖3 p65及p-p65在CCI組大鼠術側TG中的表達變化A:p65在兩組大鼠術側TG內蛋白表達;B:p-p65在兩組大鼠術側TG內蛋白表達;與Sham組比較:*P<0.05

2.2.3術后TNF-α、IL-1β表達量變化 qRT-PCR結果顯示術后第14天CCI組大鼠TG中IL-1 mRNA 表達較Sham組升高(t=16.64,P<0.001),見圖4A。Western blot結果顯示術后第14天CCI組大鼠TG中IL-1蛋白表達較Sham組升高(t=4.411,P<0.05),見圖4B。 qRT-PCR結果顯示術后第14天CCI組大鼠TG中TNF-α mRNA表達較Sham組升高(t=15.38,P<0.001),見圖4C。Western blot結果顯示術后第14天CCI組大鼠TG中TNF-α 蛋白表達較Sham組升高(t=4.605,P<0.01),見圖4D。

圖4 IL-1及TNF-α在 CCI組大鼠術側 TG 中的表達變化A:IL-1在兩組大鼠術側TG內mRNA表達;B:IL-1在兩組大鼠術側TG內蛋白表達;C:TNF-α在兩組大鼠術側TG內mRNA表達;D:TNF-α在兩組大鼠術側TG內蛋白表達;與Sham組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

圖5 各組大鼠在給予TLR7抑制劑HCQ后不同時間點機械痛閾的變化與CCI組比較:**P<0.01,***P<0.001;與CCI+NS組比較:###P<0.001

2.4 HCQ對大鼠TG中p-65、p-p65及TNF-α、IL-1β表達的影響

2.4.1HCQ對TLR7表達量變化影響 與CCI組及CCI+NS組相比,qRT-PCR結果顯示,給藥后第14天CCI+HCQ組大鼠TG中TLR7 mRNA表達下降(F= 40.79,P<0.001),見圖6A。Western blot結果顯示,給藥后第14天,與CCI組及CCI+NS組相比,CCI + HCQ組大鼠TG中TLR7蛋白表達下降(F= 6.394,P<0.05),見圖6B。

圖6 TLR7在不同組大鼠術側TG中的表達變化A:TLR7在各組大鼠術側TG內mRNA表達;B:TLR7在各組大鼠術側TG內蛋白表達;a:CCI組;b:CCI+NS組;c.CCI+HCQ組;與CCI組比較:*P<0.05,***P<0.001;與CCI+NS組比較:#P<0.05,###P<0.001

2.4.2HCQ對p65及p-p65表達量變化影響 Western blot結果顯示給藥后第14天與CCI 組及CCI+NS組相比,CCI+HCQ組大鼠TG中p65蛋白表達無統(tǒng)計學差異(F=0.162,P>0.05),見圖7A。與CCI組及CCI+NS組相比,Western blot結果顯示給藥后第14天CCI+HCQ組大鼠TG中p-p65表達下降(F=6.835,P<0.05),見圖7B。

圖7 p65及p-p65在不同組大鼠術側TG中的表達變化A:p65在各組大鼠術側TG內蛋白表達;B:p-p65在各組大鼠術側TG內蛋白表達;a:CCI組;b:CCI+NS組;c:CCI+HCQ組;與CCI組比較:*P<0.05;與CCI+NS組比較:#P<0.05

2.4.3HCQ對TNF-α、IL-1β表達量變化影響 與CCI組及CCI+NS組相比, qRT-PCR結果顯示術后第14天CCI+HCQ組大鼠TG中IL-1β mRNA表達下降(t=43.74,P<0.001),見圖8A。Western blot結果顯示給藥后第14天CCI+HCQ組大鼠TG中IL-1蛋白表達下降(F=13.58,P<0.01),見圖8B。CCI組及CCI+NS組相比,qRT-PCR結果顯示給藥后第14天CCI+HCQ組大鼠TG中TNF-α mRNA表達下降(t=12.57,P<0.01),見圖8C。Western blot結果顯示給藥后第14天CCI+HCQ組大鼠TG中TNF-α蛋白質表達下降(F=5.291,P<0.05),見圖8D。

圖8 IL-1及TNF-α在不同組大鼠術側TG中的表達變化A:IL-1在各組大鼠術側TG內mRNA表達;B:IL-1在各組大鼠術側TG內蛋白表達;C:TNF-α在各組大鼠術側TG內mRNA表達;D:TNF-α在各組大鼠術側TG內蛋白表達;a:CCI組;b:CCI+NS組;c:CCI+HCQ組;與CCI組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與CCI+NS組比較:#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001

3 討論

Toll樣受體(TLRs)家族通過識別病原體相關分子模式和危險相關分子模式、在感染性病原體入侵或組織損傷時啟動炎癥信號級聯反應信號,在先天免疫反應中發(fā)揮關鍵作用。TLRs在中樞神經系統(tǒng)(CNS)的非神經元和神經元細胞類型中表達,調節(jié)疼痛和瘙癢的信號加工過程[11]。鑒于慢性疼痛患病率以及受影響人群的痛苦,深入了解神經系統(tǒng)中的TLR信號將為臨床疼痛的治療開辟新的途徑。

TLR7表達于背根神經節(jié)(DRG)神經元,結扎第四腰(L4)脊神經(SNL)所致周圍神經損傷或坐骨神經慢性損傷后,小鼠背根神經節(jié)TLR7在mRNA和蛋白水平的表達顯著增加。通過向同側L4 DRG微量注射表達TLR7 shRNA的腺相關病毒(AAV)5來阻斷這種增加,減輕SNL誘導的雄性和雌性小鼠的機械、熱和冷痛過敏[7]。TLR7/8均通過MyD88發(fā)出信號,包括IL-1受體相關激酶-4(IRAK-4)的募集,分別通過NF-kB和IRF7介導IFN的產生,促進促炎細胞因子的信號轉導[12]。Toll樣受體7(TLR7)通過其識別ssRNA的能力觸發(fā)抗病毒免疫反應。TLR7蛋白的蛋白水解裂解是其在內體區(qū)室中功能成熟所必需的。結構研究表明,TLR7的N和C端結構域在裂解后連接并參與配體結合。羥基氯喹(hydroxychloroquine,HCQ)是一種抗瘧藥物,已被研究其抗病毒作用。HCQ可增加酸性細胞器的pH值,據報道可有效抑制內體TLR7活化[13]。

越來越多的數據表明,將受體介導的信號轉移到細胞核以調節(jié)促痛因子和抗痛因子的NF-κB與神經性疼痛的過程有關[10]。NF-κB在周圍神經損傷后在DRG神經元中被激活,相關研究表明[14]鞘內注射NF-κB抑制劑(PDTC),減少促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)和神經生長因子在DRG中的表達,緩解神經性疼痛。此外,有學者[15]發(fā)現在腰椎間盤突出癥(LDH)誘導的神經性疼痛中出現DRG中的NF-κB激活,而p65抑制劑PDTC對NF-κB的下調顯著減輕LDH誘導的大鼠機械異常性疼痛和熱痛覺過敏。

本實驗結果表明,與Sham組相比,CCI組術后第3天機械痛閾開始降低,術后第14天達到最低值;術后第14天CCI組TG中TLR7 mRNA及蛋白表達升高,提示TLR7參與了TN的發(fā)生。為進一步了解TLR7表達變化對TN大鼠的影響,在CCI術后第1天后,當大鼠TN模型穩(wěn)定構建時,對CCI+HCQ組及CCI+NS組大鼠經灌胃方式給予HCQ或生理鹽水,連續(xù)給藥14 d。實驗結果顯示HCQ抑制TLR7后,TN大鼠機械痛閾升高,TG內TLR7表達降低。此外,p-p65、TNF-α、IL-1β的表達量也下降,緩解CCI誘導的TN,從而確定了TLR7可能是TN潛在的治療靶點。TLR7雖然參與了TN,然而TLR7抑制劑HCQ抑制CCI誘導的TLR7/NF-κB通路的激活,這一交錯分子途徑的更多細節(jié),仍需要完成更嚴格和詳細的實驗設計。

綜上,TLR7是TN潛在的治療靶點,該實驗為TN的相關病因機制探究和臨床治療提供了新方向。