早期抑制TLR4對新生大鼠HIBD后青春期腦海馬免疫功能的影響

黃曉麗,歐陽志翠,吳祥宏,李 燕,黃 赟,劉國瓊,陸詩微,唐 振

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是新生兒期嚴重的神經損傷性疾病,存活者可遺患腦癱、癲癇等遠期神經功能障礙。HIBD發病機制復雜,涉及能量衰竭、自由基產生、離子失衡、興奮性神經遞質累積、氧化應激反應等多個方面[1]。神經免疫功能紊亂是參與HIBD發病的重要機制之一,各種免疫細胞激活及免疫因子異常釋放參與HIBD急性神經細胞死亡及遠期神經功能損傷。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一種廣泛分布于神經細胞膜表面的重要模式識別受體,腦組織發生缺血、創傷等損傷后,TLR4 表達上調并通過多條信號通路放大神經炎癥聯級,介導急慢性腦損傷的形成[2-3]。前期研究[4]表明缺氧缺血(hypoxic-ischemia,HI)后24h,腦海馬TLR4表達升高,早期抑制TLR4表達能減輕新生大鼠HI后腦海馬神經元缺失,并從行為學上改善大鼠青春期腦損傷預后,然而TLR4介導何種神經免疫機制參與HIBD目前并不清楚。

該研究通過早期抑制TLR4探討其調控新生大鼠HIBD模型腦海馬內各種免疫細胞活化及免疫因子表達情況,以揭示TLR4介導HIBD腦海馬損傷的神經免疫機制,為開發HIBD免疫調節治療方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立本研究經桂林醫學院倫理委員會批準(NO:GLMC202103095)。生后7 d體質量在13～19 g的Sprague Dawley大鼠按照Rice方法建立HIBD模型[5],新生大鼠經七氟烷(4%誘導,2%維持)吸入麻醉后固定,觸摸左頸總動脈波動位置,切開皮膚,顯微鏡下分離肌肉及神經,暴露左頸總動脈,5-0縫合線雙結扎后中間處離斷頸總動脈,縫合皮膚,麻醉時間不超過5 min。待幼仔麻醉蘇醒后放回母鼠窩內,1 h后將幼仔放入恒溫37.0 ℃水浴缺氧箱(自制)中,接8%O2/92%N2混合氣體1.5 L/min,維持氧濃度(8.0%±0.1%),無水氯化鈣吸收動物呼出CO2,缺氧2 h后放入母鼠處。Control組大鼠僅給予切開皮膚分離并暴露頸總動脈,既不給予結扎,也不給予缺氧。

1.2 分組與給藥新生大鼠按體質量隨機區組分成:對照(Control)組、HI組、HI+TLR4抑制劑TAK-242組(TAK-242組)。TAK-242用1%二甲基亞砜(DMSO)溶解,終濃度為0.1 mg/ml。結合課題組預實驗確定TAK-242用藥劑量為0.5mg/kg,于缺氧缺血前30 min腹腔內單次注射。Control組和HI組相同時間腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3 主要試劑TAK-242購自美國MCE公司;兔抗大鼠TLR4抗體(1 ∶200)、兔抗大鼠ICAM-1抗體(1 ∶200)、兔抗大鼠Iba-1抗體(1 ∶200)、兔抗大鼠GFAP抗體(1 ∶200)、兔抗大鼠MPO抗體(1 ∶200)、兔抗大鼠CD3抗體(1 ∶200)、兔抗大鼠IL-1β抗體(1 ∶1 000)、兔抗大鼠IL-10抗體(1 ∶1 000)及兔抗大鼠β-actin抗體(1 ∶5 000)購自英國Abcam公司;兔抗大鼠TNF-α抗體(1 ∶1 000)購自美國Santa Cruz公司;兔抗大鼠C3a抗體(1 ∶200)購自武漢 ABclonal公司;兔抗大鼠CD161抗體(1 ∶200)購自英國Serotec公司。

1.4 免疫組化及免疫熒光大鼠戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,心臟灌注后留取腦組織4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋后切取5 μm切片先后浸入二甲苯和乙醇梯度中脫蠟水化,然后放入煮沸的檸檬酸(pH 6.0)抗原修復20 min后3%H2O2中浸泡10 min,5%山羊血清室溫封閉30 min,特異性一抗4 ℃孵育過夜,次日取出玻片,PBS洗滌后相應二抗室溫孵育30 min。二氨基聯苯胺(DAB)顯色后光學顯微鏡下觀察并采集圖片,Image Pro Plus 6.0系統分析陽性區域的百分比。

用于免疫熒光檢測的5 μm切片經抗原修復后浸入0.5%Triton X-100中30 min,PBS洗滌后5%BSA封閉30 min。加入特異性一抗并在4 ℃下孵育過夜。次日取出切片洗滌后加入相應的熒光二抗避光室溫孵育60 min。DAPI復染后抗熒光猝滅劑和中性樹脂封片。暗室中熒光顯微鏡觀察并采圖。Image Pro Plus 6.0系統計數海馬CA1區陽性細胞數量。

1.5 Western blot實驗BCA蛋白質分析試劑盒測定腦海馬蛋白質濃度,制備12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠,每孔加入蛋白質(30 μg),80 V恒壓分離20～30 min后110 V繼續電泳60～90 min,恒流轉膜1 h將蛋白移到PVDF膜上。封閉后將膜與特異性一抗體4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌后,相應二抗室溫下孵育1 h,ECL化學發光顯影后ChemStudio成像系統讀取膠片并采集圖片。Image J軟件讀取圖片吸光度值。

2 結果

2.1 TAK-242早期處理對HIBD后腦海馬區TLR4表達影響免疫組化顯示HI后3 d各組大鼠腦海馬組織中TLR4呈黃褐色陽性表達,主要定位表達在神經細胞胞膜;HI組左側腦海馬CA1、CA3及DG區TLR4表達較Control組升高(P<0.01或P<0.05),而TAK-242組左側海馬CA1、CA3及DG區TLR4表達較HI組降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 HI后3 d各組大鼠海馬不同區域TLR4免疫組化圖 ×400A:Control組;B:HI組;C:TAK-242組;1:CA1區;2:CA3區;3:DG區;D:HI后3 d各組大鼠海馬TLR4相對表達直方圖(n=3);與Control組比較:*P<0.05,**P<0.01;與HI組比較:#P<0.05

2.2 早期抑制TLR4對HIBD后新生大鼠青春期腦海馬Iba-1+小膠質細胞及GFAP+星形膠質細胞的影響HI后21 d HI組左側腦海馬CA1區GFAP+細胞數量較Control組增多(P<0.01),TAK-242組左側腦海馬CA1區GFAP+細胞數量較HI組減低(P<0.05)然而各組左側腦海馬CA1區Iba-1+細胞數量差異無統計學意義(F=1.301,P=0.331)。見圖2。

圖2 HI后21 d各組大鼠海馬CA1區Iba-1+細胞及GFAP+細胞免疫熒光圖 ×400A:Control組;B:HI組;C:TAK-242組;1:Iba-1+細胞;2:GFAP+細胞;D:各組大鼠海馬CA1區Iba-1+細胞數量及GFAP+細胞數量比較;n=3～4;與Control組比較:**P<0.01;與HI組比較:#P<0.05

2.3 早期抑制TLR4對HIBD后新生大鼠青春期腦海馬CA1區MPO+中性粒細胞、CD161+自然殺傷細胞及CD3+T細胞的影響HI后21 d HI組左側腦海馬CA1區CD3+T細胞數量較Control組增多(P<0.05);盡管TAK-242組左側腦海馬CA1區CD3+T細胞數量較HI組減低,但差異無統計學意義;各組大鼠左側腦海馬CA1區MPO+中性粒細胞數量及CD161+自然殺傷細胞數量差異無統計學意義(FMPO+細胞=1.279,P=0.336;FCD161+細胞=1.612,P=0.266)。見圖3。

圖3 HI后21 d各組大鼠海馬CA1區MPO+細胞、CD161+細胞及CD3+細胞免疫熒光圖及其直方圖 ×400A:Control組;B:HI組;C:TAK-242組;1:MPO;2:CD161;3:CD3;D:各組大鼠海馬CA1區MPO+、CD161+及CD3+細胞數量比較;n=3～4;與Control組比較:**P<0.01

2.4 早期抑制TLR4對HIBD后新生大鼠青春期腦海馬CA1區黏附因子ICAM-1及補體C3a表達的影響HI后21 d HI組左側腦海馬CA1區ICAM-1表達平均吸光度值較Control組增高(P<0.05),但TAK-242不能降低HI后左側腦海馬CA1區ICAM-1表達水平增加(P>0.05)。各組大鼠左側腦海馬CA1區C3a表達平均吸光度值差異并無統計學意義(F=1.274,P=0.337)(圖4A、B)。

2.5 早期抑制TLR4對HIBD后新生大鼠青春期腦海馬TNF-α、IL-1β及IL-10表達的影響HI后21 d HI組左側腦海馬TNF-α及IL-1β表達較Control組增高,TAK-242組TNF-α及IL-1β表達較HI組降低,但差異無統計學意義;HI后21 d HI組左側腦海馬IL-10表達較Control組降低,TAK-242組IL-10表達較HI組上升,但差異無統計學意義。見圖5。

3 討論

小膠質細胞及星形膠質細胞是中樞神經系統常駐的免疫細胞,它們的數量和功能狀態代表腦內神經免疫應答狀態。腦損傷發生可誘導小膠質細胞持續活化,Loane et al[6]在小鼠腦創傷模型中發現,腦損傷1年后皮質中仍能觀察到持續的小膠質細胞激活,并伴有炎癥因子和氧化應激的標志物升高,這些與病灶擴張、海馬神經退行性變和髓鞘喪失相關。盡管本研究并未在統計學上發現HIBD后21 d各組大鼠腦海馬CA1區小膠質細胞有差異,但HI組小膠質細胞數量較Control組高[(161.3±22.7)/fieldvs(143.3±17.7)/field];反應性星形膠質細胞形成是HI誘導星形膠質細胞活化的重要形式,40%HIBD嬰兒腦白質內存在反應性星形膠質細胞[7],本研究亦顯示HI后21 d HI組腦海馬星形膠質細胞數量仍高于對照組。TLR4定位表達于星形膠質細胞表面,并在其活化過程中發揮重要作用。LPS誘導的P14小鼠癲癇模型中發現,星形膠質細胞表面TLR4被激活并介導神經突觸改變而誘發小鼠持續癲癇,TLR4阻斷后星形膠質細胞活化下降,腦損傷減輕[8]。本研究證實抑制TLR4能夠降低新生兒腦海馬HIBD后21 d星形膠質細胞激活,這可能是改善新生兒HIBD神經損傷的一種方法。

損傷激活的外周免疫細胞通過破壞的血腦屏障進入腦內,與常駐免疫細胞一起參與腦損傷形成。中性粒細胞參與成人腦卒中后損傷形成,且與腦卒中后行為障礙相關。HI暴露的新生兒大腦中性粒細胞亦可迅速在腦組織中累積,參與HI所致神經損傷[9]。不同于中性粒細胞,新生兒HI后3～7 d T淋巴細胞才出現在損傷部位,并可長時間持續存在[10]。本研究亦發現HI后21 d CD3+T淋巴細胞在腦海馬內明顯升高,這些結果提示T淋巴細胞更可能參與HI后的慢性免疫炎癥反應;成年腦缺血模型中發現HI后腦組織內有NK細胞浸潤,且獨立于T細胞參與腦損傷形成,盡管新生兒外周NK細胞功能不成熟,神經毒性作用弱,然而早期脾臟切除降低外周NK細胞水平仍對HIBD有神經保護作用[11]。TLR4是炎癥細胞激活的重要受體,在腦卒中及膿毒血癥發病過程中通過激活中性粒細胞、T淋巴細胞及NK細胞誘導腦損傷[12],課題組前期研究[13]亦發現早期抑制TLR4能夠抑制HIBD后24 h及7 d時間點中性粒細胞,T淋巴細胞及NK細胞激活,然而本研究并未發現早期抑制TLR4能改善新生大鼠HIBD后青春期腦內海馬組織中性粒細胞、T淋巴細胞及NK細胞數量改變,提示TLR4可能未參與新生兒HIBD遠期腦損傷后中性粒細胞、T淋巴細胞及NK細胞激活。

TNF-α、IL-1β是兩種重要的促炎細胞因子,腦損傷后短期內表達水平增加,與腦損傷的嚴重程度呈正相關,同時損傷誘導腦組織中免疫細胞的激活可影響抑炎因子如IL-10分泌。本研究并未發現新生大鼠HIBD后21 d海馬區TNF-α、IL-1β及IL-10表達異常,需進一步動態觀察免疫因子變化以明確其在HIBD中的作用。腦缺血或出血后,內皮細胞被激活并表達ICAM-1,形成黏附表面以降低免疫細胞運動并使其聚集在腦損傷部位。病毒性腦炎模型中,TLR4mut小鼠較TLR4WT小鼠表達更低水平ICAM-1,同時血腦屏障功能障礙得到改善[14]。本研究結果顯示HIBD后21 d海馬CA1區ICAM-1表達仍有升高,提示ICAM-1可能參與HIBD慢性損傷,TLR4早期干預并不能改善新生大鼠HIBD后青春期腦海馬ICAM-1表達。補體C3是血清中含量最高的補體成分,在補體經典激活途徑和旁路激活途徑中均發揮重要作用。Jarlestedt et al[15]研究表明C3a基因缺陷小鼠HIBD較對照組嚴重,而早期給予外源性C3a治療可以降低HIBD損傷。本研究結果未顯示HI后21 d腦海馬CA1區C3a表達異常,提示補體C3a并未參與TLR4通路介導的新生大鼠HIBD遠期損傷。

該研究揭示TLR4能夠介導新生大鼠HIBD后青春期腦海馬星形膠質細胞激活,這為改善新生兒HIBD慢性損傷提供了一種免疫治療的理論基礎;然而TLR4介導HIBD后星形膠質細胞激活機制并不清楚,同時是否存在其他免疫機制參與HIBD遠期腦損傷,這些有待進一步研究。