miR-200b對小鼠矽肺纖維化的抑制作用

袁翠芳,李 航,熊余璐,郭梓燁,王 颿,陳茹茹,郝小惠,2,劉和亮,2,郭靈麗,2

矽肺是一種由于吸入游離二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)粉塵而引起的慢性間質性肺病,其主要特征包括慢性炎癥、肺部炎性肉芽腫、遲發性肺間質纖維化和進行性呼吸功能障礙[1]。矽肺是我國最嚴重的職業病,國家衛生健康委員會發布的文件顯示,2020年我國新增職業性塵肺病患者14 367例,死亡6 668例[2]。矽肺不僅威脅著工人的身心健康,還給國家帶來了巨大的經濟負擔,是許多國家迫切需要解決的嚴重公共衛生問題。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一種長度為19～22個核苷酸的內源性非編碼小RNA,微小RNA-200b(microRNA-200b,miR-200b)是miR-200家族中的一員[3],有研究[4-6]報道miR-200b在腎臟纖維化、口腔黏膜纖維化和心臟纖維化等多種纖維化疾病中發揮重要作用。然而,miR-200b在矽肺纖維化中的作用及機制尚不清楚。該研究通過構建小鼠矽肺纖維化模型并給予miR-200b模擬物(miR-200b agomir)干預,通過肺功能檢測、肺組織病理學檢測等手段,以期明確miR-200b在矽肺纖維化發病過程中的可能作用,為尋找有效治療矽肺纖維化的靶點提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 24只SPF級雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡,體質量16～18 g)購自北京華阜康生物科技股份有限公司。實驗小鼠飼養在溫度(23℃±2℃)和濕度(60%±10%)可控的房間內,光照-黑暗交替循環12 h,可以自由進食和飲水。所有實驗操作均得到了華北理工大學實驗動物倫理委員會批準(編號:SQ2022122)。

1.1.2主要儀器和試劑 SiO2(美國Sigma公司),其中99%粒徑為0.5～10 μm,使用前充分研磨并于180 ℃烘烤2 h,脫水除去內毒素;miR-200b agomir(廣州市銳博生物科技有限公司);轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);甲醛溶液(天津市津東天正精細化學試劑廠);伊紅和蘇木精染液(珠海貝索生物技術有限公司);Masson染液試劑盒(北京雷根生物科技有限公司)。Fine Pointe Whole Body Plethysmography全身體積描記系統(美國Buxco公司);酶標儀(美國Molecular Device公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與處理 將C57BL/6小鼠隨機分為4組:對照組、SiO2組、SiO2+agomir-NC組和SiO2+miR-200b agomir組,每組6只。SiO2組小鼠予以一次性氣管滴注50 μl生理鹽水溶解的SiO2(5 mg/只)懸液;SiO2+agomir-NC組、SiO2+miR-200b agomir組氣管分別注入50 μl含5 nmol agomir的陰性對照(agomir-NC)、miR-200b agomir 的SiO2懸液,造模第7天再次氣道滴注2.5 nmol agomir-NC、miR-200b agomir 干預;對照組滴注等量生理鹽水。造模第14天測定小鼠肺功能后將其處死。

1.2.2小鼠支氣管肺泡灌洗 使用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉小鼠后,將小鼠仰臥位固定于手術板上,沿頸正中線處剪開約1 cm的小口,鈍性分離氣管周圍肌肉以暴露氣管,在氣管插管的情況下,采用止血鉗將小鼠右肺結扎,使用1.5 ml(0.5 ml×3次)無菌PBS溶液緩慢灌洗左肺,收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。將得到的BALF在4 ℃以1 000 r/min離心6 min,吸出上清液并儲存在-80 ℃用于總蛋白濃度測定和ELISA分析。加入0.1 ml PBS重懸剩余的細胞沉淀,隨后使用血細胞計數板計算白細胞總數。

1.2.3小鼠肺組織病理學檢查 在室溫下將小鼠右下部肺組織置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h后流水過夜,然后將肺組織依次放入60%、70%、80%、90%和無水乙醇中各2 h進行脫水,隨后放入醇苯混合液、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各20 min進行透明,接著將肺組織在60 ℃下浸入蠟液中6 h以上,最后將標本包埋于石蠟中并切成5 μm的切片。進行HE和Masson染色,染色操作均按試劑盒說明書進行,最后使用光學顯微鏡觀察拍照。

1.2.4小鼠BALF中TGF-β1含量的測定 采用酶聯免疫雙抗夾心法測定上述BALF中TGF-β1的水平,實驗操作均按照試劑盒說明書進行,根據樣本在波長450 nm處吸光度值以及標準曲線,計算樣品中TGF-β1的濃度。

2 結果

2.1 HE染色結果如圖1所示,與對照組相比,SiO2組和SiO2+agomir-NC組小鼠肺泡壁增厚,肺組織存在炎癥細胞浸潤和少量細胞結節,而SiO2+miR-200b agomir組小鼠肺組織中炎癥細胞浸潤程度減輕、細胞結節數量減少。

圖1 小鼠肺組織HE染色結果×200A:對照組;B:SiO2組;C:SiO2+agomir-NC組;D:SiO2+miR-200b agomir組

2.2 Masson染色結果Masson染色結果(圖2)顯示,與對照組相比,SiO2組和SiO2+agomir-NC組小鼠肺泡間隔和細支氣管區可以看到膠原沉積,而SiO2+miR-200b agomir組小鼠肺間質膠原沉積顯著減少。

2.3 小鼠肺功能檢測結果如表1所示,與對照組比較,SiO2組和SiO2+agomir-NC組小鼠呼吸頻率(frequency,f)加快、呼吸暫停(pause,PAU)次數增加(P<0.05),呼氣峰值時間比率(ratio rate of achieving peak expiatory flow,Rpef)降低(P<0.05)。與SiO2組相比,SiO2+miR-200b agomir組小鼠f和PAU減少,Rpef升高(P<0.05)。

表1 各組小鼠肺功能檢測結果

2.4 小鼠BALF中總蛋白濃度、白細胞總數和TGF-β1的含量BALF中總蛋白濃度的高低和白細胞數量的多少可以反映肺部炎癥的水平,而TGF-β1作為一個經典的促纖維化細胞因子與肺部的纖維化水平密切相關。由表2可知,與對照組比較,SiO2組和SiO2+agomir-NC組小鼠BALF中總蛋白濃度、白細胞總數和TGF-β1的含量均增加(P<0.05),而SiO2+miR-200b agomir組小鼠上述3項指標的含量均低于SiO2組(P<0.05)。

表2 各組小鼠BALF中總蛋白濃度、白細胞總數和TGF-β1含量的比較

3 討論

矽肺是一種由于吸入SiO2粉塵而引起的嚴重的職業性呼吸系統疾病,以肺部炎癥和纖維化為主要特征。我國是矽肺患者最多的國家,每年因矽肺造成的直接經濟損失超過80億元人民幣[7]。然而,矽肺的發病機制目前尚不明確,臨床上缺乏有效的治療藥物。因此,研究矽肺的發病機制,探索新的防治方法具有重要意義。miRNAs是一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA,它可以與靶基因mRNA序列的3′UTR區域互補結合,抑制靶基因的翻譯或降解其信使RNA[8]。已有研究[9-10]證實多種miRNAs參與了矽肺纖維化,然而,有關miR-200b在矽肺纖維化中的作用及機制還不清楚。

本研究通過一次性氣管滴注SiO2顆粒建立小鼠矽肺纖維化模型,病理染色結果顯示,SiO2組和SiO2+agomir-NC組小鼠肺組織均存在明顯的炎癥細胞浸潤和膠原的沉積,而經miR-200b agomir干預可以緩解SiO2引起的病理變化。BALF中總蛋白濃度和白細胞總數是反映肺部炎癥的重要指標,此研究表明miR-200b agomir干預可以降低以上指標的變化。上述結果均說明miR-200b agomir可以一定程度減輕小鼠肺部炎癥反應,抑制肺部纖維化的發生發展。已有研究[11]報道吸入SiO2可誘導大鼠雙期肺反應,表明暴露于SiO2的大鼠存在“炎癥”和“纖維化”階段。在本研究中,SiO2組小鼠肺組織存在明顯的炎癥細胞浸潤而無明顯的矽結節,可能是暴露于SiO214 d時小鼠仍處于炎癥階段,暴露時間較短,不足以形成明顯的矽結節,在后續的實驗中應適當延長SiO2暴露時間。

隨著肺組織纖維化病情的發展,會引發氣體交換功能障礙和肺功能損傷[12]。小鼠肺功能檢測結果發現,SiO2+miR-200b agomir組小鼠f、PAU和Rpef較SiO2組和SiO2+agomir-NC組均得到明顯改善。另外,矽肺是一種復雜的慢性炎癥過程,涉及多種細胞、細胞因子和多種介質。肺泡巨噬細胞是矽肺的主要免疫細胞,在矽肺的發生發展中起著至關重要的作用。多項研究[13]表明,肺泡巨噬細胞可以通過清道夫受體以電荷依賴的方式識別并吞噬SiO2顆粒,從而增加炎性和纖維化介質的釋放。在這些與纖維化相關的細胞因子中,TGF-β1起著關鍵作用,被認為是矽肺的起點。越來越多的證據[14]表明,TGF-β1作為一種強大的促纖維化細胞因子,它可以通過誘導成纖維細胞合成細胞外基質,包括膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等。本研究中,SiO2組和SiO2+agomir-NC組小鼠BALF中TGF-β1的表達水平升高,但是給予miR-200b agomir干預后TGF-β1的分泌降低,這提示SiO2暴露可以促進呼吸道和肺組織免疫細胞合成和釋放TGF-β1,而當使用miR-200b agomir干預后,可以有效阻止該因子的合成,進而緩解矽肺纖維化。

綜上所述,該研究表明miR-200b可以有效減緩矽肺小鼠肺功能的下降、抑制矽肺纖維化的發生發展,提示miR-200b可能是治療矽肺纖維化的潛在靶點。該研究僅從靶向干預的角度闡述了miR-200b在實驗性小鼠矽肺纖維化中的作用,然而其對矽肺進程的具體作用機制仍需進一步探討。