塞來昔布下調JAML抑制糖尿病視網膜病變大鼠VEGF的表達及其機制

段 梅,曹 凡,桂衍超,陳可洋,陶黎明,蔣正軒

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病眼病的主要并發癥之一,已成為我國成年人群致盲的首位疾病[1]。DR發病率高、病因復雜,發病機制尚不完全清楚。研究[2]表明,慢性炎癥和高糖導致的視網膜缺氧在DR的發病過程中發揮重要的作用。塞來昔布是一種選擇性非甾體消炎藥,廣泛用于抗炎和鎮痛等治療。Amrite et al[3]研究證實眼周注射塞來昔布可抑制DR視網膜中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的升高,但其機制并不清楚。連接黏附分子樣蛋白(junctional adhesion molecule-like protein, JAML)主要表達于腎小球足細胞、心血管內皮細胞[4-5]。研究[6]顯示,JAML不僅增強白細胞和內皮細胞的黏附作用,還可以介導細胞內炎癥反應,在炎癥和損傷修復中發揮關鍵作用。目前,塞來昔布減輕DR發生的機制尚不清楚。該研究將在DR中研究塞來昔布對JAML表達的影響,以及塞來昔布對DR視網膜VEGF的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級8周齡雄性SD大鼠45只,體質量180～200 g(安徽醫科大學動物實驗中心提供),大鼠置于12 h/12 h光照黑暗交替、溫度(25±1)℃、濕度(50±5)%的環境下,自由進食飲水,適應性喂養1周。該研究獲得安徽醫科大學第二附屬醫院科研和臨床試驗倫理委員會批準(編號:2021049)。遵守實驗動物使用原則、護理原則及3R原則使用實驗動物。

1.1.2主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、HE染色試劑盒(貨號:1120)購于北京索萊寶科技有限公司;枸櫞酸鈉、枸櫞酸三鈉、戊巴比妥均購自北京國藥集團化學有限公司;塞來昔布購于美國輝瑞制藥有限公司;原代人臍靜脈內皮細胞(primary human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)和ECM培養基購自美國sciencell公司;胎牛血清由以色列BI公司提供;D-葡萄糖購于德國biofroxx公司;0.25%胰酶細胞消化液(貨號:C0203)、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(貨號:C0223)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0010)均購自上海碧云天生物有限公司;無血清細胞凍存液(貨號:C40100)購于蘇州新賽美生物科技公司;Anti-JAML抗體(貨號:ab183714)購自英國Abcam公司;抗磷酸化磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositol kinase-3,P-PI3K)抗體(貨號:AF3242),抗磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidy-linostiol kinase-3,PI3K)抗體(貨號:AF6242),抗缺氧誘導因子1-α(hypoxia-inducible factor1-α,HIF1-α)抗體(貨號:BF8002),抗白介素-10抗體(DF6894),抗VCAM-1抗體(DF6082)均購自溧陽親科生物公司;抗VEGF抗體(貨號:R26074)購自成都正能生物公司;總膽固醇(total cholesterol,TC)檢測試劑盒(貨號:A111-1-1)購自南京建成公司;胰島素(Insulin)檢測試劑盒(貨號:CSB-E05070r)購于武漢華美科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠糖尿病模型建立 將45只大鼠隨機分為3組,分別為正常對照(NC)組、DR組、塞來昔布干預DR(DR+C)組,每組15只。DR組和DR+C組大鼠按60 mg/kg劑量腹腔注射STZ(以pH為4.5的0.1 mmol/L的枸櫞酸鹽緩沖液稀釋),NC組注射等量枸櫞酸鹽溶液。注射3 d后禁食8 h,采尾靜脈血測血糖濃度,以空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)>16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。FPG<16.7 mmol/L大鼠繼續普通飼料喂養1周,重復造模,用2周造模成功。建模1個月后使用塞來昔布以50 mg/kg劑量每日單次灌胃,連續2個月。每周1次觀察并記錄3組大鼠進食量,飲水量及精神狀態;每周測量1次體質量、1次FPG。

1.2.2SD大鼠視網膜組織病理變化 按5 ml/kg劑量腹腔注射1%的戊巴比妥鈉全身麻醉SD大鼠,摘取右側眼球,4%多聚甲醛固定24 h后流水沖洗,梯度乙醇脫水后用二甲苯透明并透蠟,然后包埋;沿矢狀面垂直視神經做石蠟切片,切片厚度3 μm;脫蠟后蘇木素染色3 min,自來水返藍,伊紅染色,使用中性樹膠封片。400倍光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3免疫組織化學染色法(immunohistochemistry,IHC)檢測SD大鼠視網膜組織中白介素(interleukin,IL)-10、血管細胞黏附分子-(vascular cell adhesion molecules-1,VCAM-1)蛋白表達 每組選取3張石蠟切片,進行IHC實驗。60 ℃恒溫烘烤切片,脫蠟、梯度乙醇(100%-95%-80%)浸洗3次,之后流水沖洗切片至透明;將切片放入高壓鍋中,2 min后取出,滴加3%H2O2室溫孵育10 min,PBS-T洗3次,山羊血清室溫封閉20 min,甩干后滴加IL-10(1 ∶150)、VCAM-1(1 ∶100)一抗,37 ℃孵育1 h;取出滴加二抗孵育,洗凈后滴加DAB顯色劑。蘇木精染色,常規脫水,封片。使用Image J軟件計算每張切片中陽性染色區域的平均灰度值,代表蛋白的表達情況。

1.2.4Western blot法檢測JAML、PI3K、P-PI3K、HIF1-α、VEGF等蛋白在大鼠視網膜組織的表達 稱取視網膜組織20 mg,加入RIPA裂解液勻漿,離心,取上清液,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白含量。按每孔20 μg上樣量進行Western blot實驗。使用Image J軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白表達量=目的條帶灰度值/相對應內參灰度值。

1.2.5檢測血清中TC、Insulin含量 SD大鼠糖尿病建模3個月末,1%戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠,經眶靜脈取空腹血,4 ℃凝固后,3 000 r/min離心10 min, 取上層血清檢測TC、Insulin含量。

1.2.6細胞培養 取出液氮凍存的HUVEC細胞放入37 ℃水浴鍋解凍,然后轉移至含有ECM完全培養基的離心管中,離心,棄上清液;完全培養基重懸細胞,接種到培養瓶中,于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養,待細胞融合至80%時使用0.25%胰酶細胞消化液消化,終止消化后收集細胞,并制成單細胞懸液。按每孔2.5×105個細胞含量接種于6孔板中培養24 h。將細胞分為3組:正常葡萄糖(normal glucose,NG)組細胞采用無血清培養基培養,高糖(high glucose,HG)組細胞在含有30 mmol/L的葡萄糖無血清培養基中培養,高糖加藥塞來昔布(high glucose and celecoxib,HG+C)組細胞在含有30 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L塞來昔布的無血清培養基中培養。塞來昔布溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。

1.2.7Western blot法檢測3組細胞JAML、PI3K、P-PI3K、HIF1-α、VEGF等蛋白的表達 將處理后的細胞培養24 h,使用細胞刮收集細胞,提取細胞總蛋白,按每孔20 μg蛋白含量進行Western blot實驗。用Image J軟件分析各條帶灰度值以計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 3組SD大鼠體質量、血糖、飲食、飲水的變化情況NC組大鼠毛發明亮,體型肥碩;DR+C組、DR組大鼠體型瘦削,毛色暗淡。DR+C、DR組大鼠體質量均低于NC組(F組別=39.13,P<0.01),而DR+C組與DR組差異無統計學意義(圖1A和表1)。DR+C組、DR組FPG水平均高于NC組(F組別=318.7,P<0.01),而DR+C組與DR組FPG水平差異無統計學意義(圖1B和表1)。DR+C組、DR組12 h進食量與NC組比較差異無統計學意義(F組別=1.704,P>0.05)(圖1C和表1);DR+C、DR組12 h飲水量較NC組增多(F組別=9.438,P<0.05)(圖1D和表1)。

圖1 3組SD大鼠體質量、FPG、飲食、飲水變化情況A:體質量;B:FPG;C:飲食;D:飲水

2.2 3組SD大鼠視網膜組織病理變化情況NC組細胞排列整齊,結構層次清晰;DR+C組和DR組視網膜疏松,層間結構不清;DR組大鼠視網膜血管擴張,內界膜不連續。3組大鼠視網膜厚度分析顯示:DR+C組視網膜厚度、內叢狀層(IPL)、內核層(INL)、外叢狀層(OPL)、外核層(ONL)厚度低于DR組(P<0.05);DR+C組與NC組視網膜厚度、內核層、內叢狀層厚度差異無統計學意義。見圖2。

2.3 3組SD大鼠視網膜組織中IL-10、VCAM-1蛋白表達情況對3組大鼠進行干預2個月后,采用IHC檢測視網膜組織中IL-10、VCAM-1的蛋白表達水平。結果顯示,DR組IL-10、VCAM-1蛋白表達水平高于NC組(分別為P<0.001,P<0.01),DR+C組大鼠視網膜中IL-10、VCAM-1蛋白表達水平低于DR組(均P<0.01)。見圖3。

圖3 3組SD大鼠視網膜組織中IL-10、VCAM-1蛋白表達情況 ×400A、B:IHC檢測視網膜組織中IL-10的蛋白表達及其直方圖;C、D:IHC檢測視網膜組織中VCAM-1的蛋白表達及其直方圖;a:NC組;b:DR組;c:DR+C組;黑色箭頭:指示陽性染色;與NC組比較,**P<0.01,***P<0.001;與DR+C組比較:##P<0.01

2.4 3組SD大鼠血清TC、Insulin含量變化情況3組SD大鼠進行干預2個月后,檢測大鼠血清TC、Insulin含量。DR+C組、DR組血清TC含量較NC組升高(P<0.01);而DR+C組與DR組相比差異無統計學意義。DR+C組和DR組中血清Insulin含量較NC組均下降(P<0.001);DR+C與DR組相比差異無統計學意義。見圖4。

圖4 3組大鼠血清TC、Insulin量變化情況A:TC; B:血清Insulin;與NC組比較:**P<0.01,***P<0.001

2.5 3組SD大鼠視網膜中JAML、VEGF表達水平及PI3K/ HIF1-α信號通路的分子表達情況Western blot法檢測JAML和VEGF的表達水平,結果顯示:DR組中JAML和VEGF蛋白表達水平高于NC組(P<0.001);DR+C組JAML、VEGF的表達水平低于DR組(P<0.001)。Western blot法進一步檢測了PI3K/HIF1-α信號通路關鍵分子的表達水平,結果顯示:DR組中PI3K、p-PI3K、HIF1-α蛋白表達水平較NC組升高(P<0.001);DR+C組中PI3K、p-PI3K、HIF1-α蛋白表達較DR組降低(P<0.001)。見圖5。

圖5 3組大鼠視網膜組織JAML、P-PI3K、PI3K、HIF1-α、VEGF等蛋白分布情況A:JAML、P-PI3K、PI3K、HIF1-α、VEGF等蛋白的蛋白實驗結果;B～F:分別為JAML、P-PI3K、PI3K、HIF1-α、VEGF的蛋白實驗結果直方圖;a:NC組;b:DR組;c:DR+C組;與NC組比較:***P<0.001;與DR+C組比較:###P<0.001

2.6 3組HUVEC細胞中JAML、VEGF表達水平及PI3K/HIF1-α信號通路的分子表達情況Western blot法檢測HUVEC細胞中JAML和VEGF的蛋白表達水平,結果顯示:HG組細胞中JAML和VEGF的表達水平高于NG組(P<0.05);HG+C組JAML、VEGF蛋白水平低于HG組(P<0.05)。Western blot法進一步檢測PI3K/HIF1-α信號通路的分子表達水平:HG組細胞P-PI3K、HIF1-α的分子表達水平高于NG組(P<0.05)。HG+C組P-PI3K、HIF1-α蛋白水平低于HG組;3組HUVEC細胞中PI3K表達水平差異無統計學意義。見圖6。

圖6 3組HUVEC細胞JAML、P-PI3K、PI3K、HIF1-α、VEGF蛋白表達水平

3 討論

DR是糖尿病引起的視網膜微血管的嚴重并發癥。研究[3]表明,塞來昔布能降低視網膜中炎癥因子水平,延緩DR的發生,但具體的分子機制尚不清楚。基于塞來昔布可延緩DR進展的重要作用,本研究旨在探討其在DR視網膜炎癥反應中的作用機制。本研究結果顯示:DR大鼠經塞來昔布灌胃后視網膜中的IL-10、VCAM-1、HIF1-α、VEGF蛋白的表達降低;體外高糖誘導后的HUVEC細胞中證實,塞來昔布可降低高糖環境下內皮細胞HIF1-α、VEGF蛋白的表達。以上結果表明,塞來昔布可以減輕DR視網膜組織的炎癥發應,降低VEGF的水平從而延緩DR的發生。

JAML是連接黏附分子(JAMs)家族成員,可促進白細胞在內皮細胞的黏附,破壞血管屏障功能,導致炎癥的發生[6]。最近研究[7]表明,當細胞受到損傷刺激后,JAML的表達增加從而影響創傷修復。Fu et al[4]在糖尿病腎病的研究中發現JAML參與足細胞脂質代謝的穩態調控。糖尿病腎病與DR均是糖尿病導致的微血管病變,兩者在發病的過程中有相似的病理特征。因此,本研究檢測JAML是否參與塞來昔布減輕DR的作用機制。研究結果也顯示高糖刺激下HUVEC細胞以及STZ誘導DR大鼠視網膜組織中JAML表達水平上調,其表達水平與炎癥因子IL-10、VCAM-1等相關。塞來昔布干預后,JAML在DR大鼠視網膜和DR細胞模型中表達下降。這些結果顯示,塞來昔布降低了JAML的表達,減輕了DR視網膜組織和高糖誘導的HUVEC細胞的炎癥反應。研究表明,JAML蛋白位于內皮細胞的細胞膜,其胞內結構所具有的蛋白序列能夠聚集PI3K,從而將外界的信號傳遞到細胞內進而介導細胞內下游分子的表達。JAML胞內段具有的PI3K聚集序列可以激活細胞的HIF1-α信號通路[8-10];并且有研究[11]表明,抑制HIF1-α的活化可以上調HUVEC細胞中VEGF的表達水平。基于以上的研究成果,本研究進一步探討了JAML參與DR發生的信號通路。結果顯示,DR大鼠視網膜PI3K、P-PI3K、HIF1-α的表達增高。塞來昔布干預后,DR大鼠視網膜PI3K、P-PI3K、HIF1-α蛋白表達下降。因此,塞來昔布可以減輕DR發生,其機制可能與JAML介導的 PI3K/HIF1-α信號通路有關。

本研究首先通過HE染色證實了DR大鼠視網膜新生血管形成,并通過Western blot檢測出JAML、IL-10、VCAM-1在DR中表達升高;塞來昔布干預后,JAML表達降低,DR大鼠的視網膜病變緩解,炎癥因子降低。本研究在HUVEC細胞和大鼠視網膜中進一步證實了JAML介導的PI3K/HIF1-α信號通路在DR中的作用。但該研究仍存在以下不足之處:首先,研究未干預JAML的表達來證實其調控炎癥的作用機制;其次,研究中運用HE染色結果證明塞來昔布對DR發生的延緩作用,未進行視網膜造影來顯示DR導致的視網膜血管的滲漏情況;再次,研究中DR大鼠的數量盡管符合統計的要求,但是需要更大的樣本量來證實該研究結果;最后,研究未探究塞來昔布是如何調控JAML的表達,以及調控的機制。這些不足之處,將在以后的研究進一步完善。

綜上所述,該研究通過體內和體外實驗證實了塞來昔布具有延緩DR發生的作用。其機制可能是塞來昔布通過降低JAML的表達,從而介導PI3K/HIF1-α信號通路減少VEGF的生成以及發揮抗炎作用,延緩DR的發生。