一例雞毒霉形體病的診斷與體會

霍 偉

（山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 泰安 271000）

雞毒霉形體病雖然致死率較低，但會引起商品肉雞胴體品質(zhì)降低、飼料利用率降低、幼雛死淘汰率上升，且在新城疫疫苗免疫期間，極易誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的損失。雞毒霉形體病呈世界性分布，隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，其危害日趨嚴(yán)重[1]。如何有效地控制該病的發(fā)生已成為當(dāng)前亟待解決的問題[2]。

本病傳播迅速，常年可發(fā)生，以寒冷季節(jié)較嚴(yán)重，多因雞舍通風(fēng)不良，空氣污濁等不良刺激而誘發(fā)。在商品肉仔雞飼養(yǎng)中常呈流行性，成年雞多為散發(fā)性。臨床癥狀以呼吸道癥狀為主。病理變化為鼻道和眶下竇黏膜水腫、充血，喉頭和氣管內(nèi)有粘稠的滲出物。病程長的氣囊壁增厚混濁，有黃白色的干酪樣物，嚴(yán)重者可見纖維素性或化膿性肝被膜炎和心包炎[1,3,4]。雞毒霉形體病的癥狀常易與其他呼吸道疾病相混淆。因此，該病的確診要依靠病理剖檢、血清學(xué)檢測和病原分離等綜合診斷。

目前雞毒霉形體病除用疫苗預(yù)防外，藥物控制是防治該病的有效途徑。但由于長期不合理的使用抗菌藥物，致使耐藥菌株日益增多，藥物治療效果越來越差。不僅如此，因雞毒霉形體體外培養(yǎng)生長緩慢，培養(yǎng)條件要求苛刻，病原不易分離[5]。

本文針對一雞場發(fā)現(xiàn)疑似毒霉形體病，從病雞的診斷、藥敏試驗等方面進行闡述，本研究為該場臨床準(zhǔn)確用藥提供科學(xué)指導(dǎo)，對雞毒霉形體病的準(zhǔn)確診斷以及治療提供一定的理論依據(jù)。

1 發(fā)病情況

該雞場有雞2 000 余羽，發(fā)病主要集中在4～8 周齡小雞，病雞發(fā)育不良，羽毛無光蓬松，表現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，輕微八字，部分跛行；有大量尿酸或尿酸鹽的綠色排泄物；冠下塌，有些病雞的冠是藍白色的；關(guān)節(jié)周圍有腫脹達鴿卵大，胸部水泡，跗關(guān)節(jié)及足掌是主要感染部位；部分雞打噴嚏，漿液性鼻涕，咳嗽，出現(xiàn)喘氣音；部分病雞眼球凸出，解剖發(fā)現(xiàn)鼻腔、氣管、喉頭內(nèi)有粘稠的滲出物。該養(yǎng)殖場負責(zé)人使用鏈霉素、磺胺噻唑治療后，病情不見好轉(zhuǎn)。對病雞進行進一步的實驗室檢測，再結(jié)合臨床癥狀、病理變化進行確診。

2 診斷

2.1 剖檢

取病雞共計18 只，剖檢發(fā)現(xiàn)氣管、鼻腔、支氣管和氣囊中含有粘液性滲出物，胸部氣囊有混濁、增厚、水腫現(xiàn)象，鼻腔黏膜潮紅發(fā)炎，氣管內(nèi)有較多黏液，部分氣囊內(nèi)有泡沫樣或干酪樣物，瀕死雞出現(xiàn)纖維素性或化膿性肝被膜炎和心包炎。

2.2 實驗室檢查

2.2.1 雞傳染性支氣管炎EL?SA 檢測 對采集的18 只病雞血清樣本，進行了雞傳染性支氣管炎抗體水平檢測，結(jié)果全為陰性。

2.2.2 雞毒霉形體的實驗室鑒定 （1）雞毒霉形體液體培養(yǎng)基的制備。用電子天平稱取霉形體肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基26 g 置于錐形瓶中，加去離子水1 000 mL，充分?jǐn)嚢?，加熱溶解，塞上棉塞，用包裝紙包扎置高壓蒸汽消毒器內(nèi)，0.105 Mpa（121.3 ℃）滅菌20 min。高壓蒸汽滅菌后，待霉形體肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃，用注射器加入健康豬血清120 mL，同時在霉形體肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶?）0.1 g、鹽酸半胱氨酸0.1 g、青霉素1 g、制霉菌素50 萬?U、酚紅0.1 g。

采用酸度計測定培養(yǎng)基pH 值，將測定儀探頭插入霉形體肉湯培養(yǎng)基中1.3～3.2 cm 深度，讀數(shù)即可。用1 mol/L 氫氧化鈉溶液將霉形體培養(yǎng)基pH 值調(diào)至7.6～7.8，然后將培養(yǎng)基分裝于滅菌的試管中，每管約4～5 mL，試管分裝完塞好棉塞并包扎（上述方法注意無菌操作）。將包扎好的霉形體液體培養(yǎng)基放入恒溫箱內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察有無細菌生長，棄去有雜菌生長的培養(yǎng)基，4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）雞毒霉形體固體培養(yǎng)基的制備。用電子天平稱取霉形體肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基26 g，瓊脂20 g，用量筒量取去離子水1 000 mL，置于錐形瓶中加熱溶解，塞上棉塞，用包裝紙扎好，將培養(yǎng)基置電熱式蒸汽消毒器內(nèi)， 0.105 Mpa（121.3 ℃）滅菌20 min。待霉形體基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃，用注射器加入健康豬血清120 ml，用電子天平稱取煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶?）0.1 g、鹽酸半胱氨酸0.1 g、青霉素1 g、制霉菌素50 萬?U、酚紅0.1 g，加入霉形體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

采用酸度計測定培養(yǎng)基pH 值。用1 mol/L氫氧化鈉溶液將培養(yǎng)基pH 值調(diào)至7.6～7.8 即可。然后將固體培養(yǎng)基分裝于滅菌的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿倒入10～15 mL，并將培養(yǎng)皿于桌面上輕輕回轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基平鋪于皿底，冷卻后即為平板培養(yǎng)基。將制備的霉形體固體培養(yǎng)基放入恒溫箱內(nèi)，37 ℃ 培養(yǎng)24 h 后，觀察有無細菌生長，棄去有雜菌生長的培養(yǎng)，4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆肹6-7]。

（3）分離培養(yǎng)及初步鑒定雞毒霉形體。取一潔凈的玻板，劃出方塊3 cm×3 cm，在方塊滴一滴雞毒霉形體平板凝集抗原，在抗原處滴等量的待檢血清，使用牙簽將抗原與被檢雞血清混勻。同時設(shè)雞毒霉形體陰性血清和雞毒霉形體陽性血清對照?；旌衔镌谑覝叵? min 內(nèi)出現(xiàn)凝集塊者為陽性反應(yīng)，沒有凝集塊者為陰性反應(yīng)。

（4）分離培養(yǎng)雞毒霉形體。剖檢平板凝集試驗為陽性的病雞，取病變的支氣管和氣囊內(nèi)容物接種于培養(yǎng)基中，采取燭缸法培養(yǎng)（圖1）。培養(yǎng)物酚紅變?yōu)殚冱S色（圖2）時再劃線接種到固體培養(yǎng)基上分離。

圖1 霉形體厭氧燭缸培養(yǎng)罐

圖2 霉形體在液體培養(yǎng)基的生長情況

（5）純化分離及鑒定。3～5 d 培養(yǎng)后，挑取呈“煎油蛋狀”的單個菌落移植到固體培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)即可得到霉形體的純培養(yǎng)物。

3 藥敏試驗

本試驗采取藥物紙片瓊脂擴散法（紙片法）[8]。

3.1 配制菌液

挑取雞毒霉形體菌落1～2 個，與5 mL 的去離子滅菌水混合充分制成懸液。

3.2 涂布菌液

取培養(yǎng)基平板，蘸取菌液棉拭子，多次用拭子涂布培養(yǎng)基表面，平板每次旋60 余度，沿平皿四周最后繞兩圈，涂布保證均勻[9]。

3.3 貼藥敏紙片

用鑷尖輕壓貼平一旦貼上就不再移動，間距大于24 mm，距平皿邊緣大于15 mm。

3.4 培養(yǎng)

37 ℃ 恒溫燭缸中培養(yǎng)4～5 d 以上，檢查抑菌直徑。

3.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

按照抑菌圈直徑的大小判斷雞毒霉形體對藥物的敏感性。抑菌圈直徑＞21 mm 為高度敏感，抑菌圈直徑12～21 mm 為中度敏感，抑菌圈直徑＜12 為不敏感。

4 結(jié)果分析

4.1 雞毒霉形體菌落形態(tài)

從岱岳區(qū)某雞場采集的18 只病雞，分離獲得雞毒霉形體11 株。其生長的培養(yǎng)基由紅色變成淡黃色，培養(yǎng)4～5 d 的菌落觀測白色呈露滴狀且生長緩慢（圖3）。光學(xué)顯微鏡下，菌落直徑在0.2～0.3 mm 之間，肉眼觀察圓形菌落呈“煎荷包蛋”樣，邊緣整齊中心顏色較深致密突起，光滑成乳頭狀（圖4）。

圖3 分離出的雞毒霉形體菌落

圖4 光學(xué)顯微鏡下雞毒霉形體菌落形態(tài)（40×）

4.2 雞毒霉形體藥物敏感性試驗

對分離獲得的雞毒霉形體分別用硫酸慶大霉素、紅霉素、磷酸替米考星、鏈霉素、泰樂菌素、北里霉素、多粘菌素、磺胺二甲嘧啶、青霉素、乳酸環(huán)丙沙星進行藥敏試驗，設(shè)置空白對照（圖5），其抑菌結(jié)果見表1。

表1 雞毒霉形體對藥物的敏感情況

圖5 各種藥物的抑菌情況

5 體會

（1）該雞群出現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀，但從臨床上難以分辨為雞毒霉形體病、雞傳染性支氣管炎或雞傳染性鼻炎。通過使用鏈霉素、磺胺噻唑治療后，沒有出現(xiàn)較好的療效，排除雞傳染性鼻炎。通過雞傳染性支氣管炎病毒抗體EL?SA 試劑盒檢測，結(jié)果全為陰性，排除雞傳染性支氣管炎。

（2）分離雞毒霉形體主要受兩大因素的影響，一是受病料的影響，二是受雞毒霉形體營養(yǎng)需要及培養(yǎng)條件的影響。病料采集是雞毒霉形體分離培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。為了提高雞毒霉形體的分離率，本試驗在分離前先進行平板凝集試驗，通過平板凝集試驗陽性的病雞采集病料。氣囊是雞毒霉形體分離的理想病料，若取氣管或支氣管分泌物常因其他雜菌過多的生長而造成分離的失敗。本試驗分別采集了病雞的支氣管內(nèi)容物和氣囊內(nèi)容物作為分離樣品。

（3）雞毒霉形體生長對水質(zhì)和pH 值要求較高，需采用三蒸水或去離子水，本試驗采用去離子水。瓊脂的質(zhì)量可影響雞毒霉形體菌落的大?。谎逄峁┠懝檀己透鞣N脂肪酸；酚紅的質(zhì)量可影響雞毒霉形體的生長。

（4）雞毒霉形體與大腸桿菌混合感染時，分離比較困難，需多次移植分離，工作量較大，且不易分離成功。由于雞毒霉形體缺乏細胞壁，在培養(yǎng)中加入青霉素抑制細菌的生長，制霉菌素抑制霉菌的生長[10]。但抑菌劑的濃度應(yīng)適宜，此外，培養(yǎng)用的玻璃器皿潔凈程度也影響雞毒霉形體生長。

6 結(jié)論

通過病雞分離獲得雞毒霉形體，藥敏實驗發(fā)現(xiàn)雞毒霉形體對泰樂菌素、紅霉素和北里霉素高度敏感，慶大霉素、替米考星為中度敏感，對鏈霉素、多粘菌素、磺胺二甲嘧啶、青霉素、乳酸環(huán)丙沙星不敏感。養(yǎng)殖戶使用北里霉素、紅霉素治療后，該養(yǎng)殖場的病雞情況明顯得到控制。