平邑地區(qū)豬源大腸桿菌敏感藥物篩選試驗

陳寧寧，張偉鋒，高大朋，董 強，丁永貴，孫 梅，李運喜

（山東省平邑縣畜牧發(fā)展促進(jìn)中心，山東 平邑 273300）

大腸桿菌是革蘭氏陰性桿菌，主要存在于腸道中，屬條件致病菌，在應(yīng)激、機(jī)體抗病能力差時，容易引起機(jī)體腹瀉等腸道疾病。大腸桿菌耐藥性是由抗生素不規(guī)范使用造成的大腸桿菌對抗生素藥物的敏感性下降，甚至不敏感現(xiàn)象。目前主要耐藥性機(jī)制有固有耐藥性和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移等獲得耐藥性[1-3]。

本試驗依據(jù)中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)介紹的動物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測定紙片擴(kuò)散法（SN/T1944-2016）進(jìn)行試驗和結(jié)果判斷[4]。試驗采集分離平邑7 家生豬養(yǎng)殖場21株大腸桿菌，檢測該場大腸桿菌對臨床常用的慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、氟苯尼考、多四環(huán)素、黏菌素6 種抗生素的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要設(shè)備 高壓滅菌鍋（ZDX-35B1），購自上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9032），購自龍口市先科儀器公司；紫外分光光度計（ULTROSPEC3100PRO），購自英國Biochrom 公司；電子分析天平（AR1530），購自奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.1.2 材料 伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基（MHA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；6 種抗生素藥敏片、革蘭氏染液購于常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 用無菌棉簽采集100 日齡左右的健康三元育肥生豬肛門拭子，放于2 mL 滅菌生理鹽水中。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）121 ℃，15 min高壓滅菌，冷卻到55 ℃（手感微燙）時，在超凈工作臺中倒入培養(yǎng)皿板，待培養(yǎng)基凝固后，倒置晾干培養(yǎng)皿蓋上的水珠后，備用。

將已放入滅菌生理鹽水的肛拭子樣品振蕩后，用接種環(huán)蘸取少量液體樣品，然后輕輕劃線于伊紅美蘭培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)16 h 左右。挑取具有金屬光澤的單個菌落，多次純化直到培養(yǎng)基上菌落形態(tài)一致。

1.2.3 鏡檢 挑取伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基具有金屬光澤的單個菌落，用生理鹽水稀釋，涂于載玻片上，自然干燥；加結(jié)晶紫溶液染色30 S，用清水沖去染液；加碘液染色30 S，用清水沖去染液；用70%酒精脫色30 S；用復(fù)紅復(fù)染30 S，用清水沖去染液；油鏡下觀察細(xì)菌成紅色、桿狀。

1.2.4 大腸桿菌藥物敏感實驗 挑取具有金屬光澤的單個菌落，致密劃線于TSA 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h。用接種環(huán)刮取TSA 上的菌落，懸浮于2 mL 生理鹽水中，用麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管校正至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬喈?dāng)于細(xì)菌1.5×108CFU/mL。用無菌棉簽蘸取菌液，在管壁內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)擠壓，去掉多余菌液，均勻涂抹到MHA 培養(yǎng)基表面。用無菌鑷子將標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物紙片貼于瓊脂表面，37 ℃培養(yǎng)16 h。

2 結(jié)果

本次試驗采集7 家生豬養(yǎng)殖場樣品，每場采集樣品7 份，共采集樣品49 份，每場分離到3株大腸桿菌，共計21 株豬源大腸桿菌。藥敏結(jié)果如表1 所示：3 株豬源大腸桿菌對恩諾沙星的抑菌圈直徑為6.3～7.0 mm，耐藥率為14%，6 株豬源大腸桿菌對恩諾沙星的抑菌圈直徑為19.9～22.1 mm，中介率29%，12 株豬源大腸桿菌對恩諾沙星的抑菌圈直徑大于23.0 mm，敏感率為57%；3 株豬源大腸桿菌對慶大霉素的抑菌圈直徑為6～7 mm，耐藥率為14%，3 株豬源大腸桿菌對慶大霉素的抑菌直徑圈為13～14 mm，中介率為14%，15 株豬源大腸桿菌對慶大霉素的抑菌圈直徑大于15 mm，敏感率約為72%；21 株豬源大腸桿菌對阿莫西林的抑菌圈直徑為 6 ～10 mm，耐藥率為100%；15 株豬源大腸桿菌對氟苯尼考的抑菌圈直徑為7～8 mm，耐藥率為71%，6 株豬源大腸桿菌對氟苯尼考的抑菌圈直徑為13.9～15.1 mm，中介率為29%，21 株豬源大腸桿菌對氟苯尼考敏感率為0；9 株豬源大腸桿菌對多四環(huán)素的抑菌圈直徑為8～12 mm，耐藥率為43%，6 株豬源大腸桿菌對多四環(huán)素的抑菌圈直徑為13～14 mm，中介率為29%，6 株豬源大腸桿菌對多四環(huán)素的抑菌圈直徑大于16 mm，敏感率為29%；21 株豬源大腸桿菌對黏菌素的抑菌圈直徑大于18 mm，敏感率100%。

表1 豬源大腸桿菌抑菌圈直徑 （mm）

3 討論與結(jié)論

2021 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)了《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案（2021—2025 年）》，2022年下達(dá)了《2022 年動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測計劃》，文件要求監(jiān)測大腸桿菌等革蘭氏陰性菌對阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、黏菌素等16 種抗菌藥的耐藥性，并在部署2022 年畜牧獸醫(yī)工作中，要求加快推進(jìn)獸用抗菌藥使用減量，山東省畜牧獸醫(yī)局在《山東省獸用抗菌藥使用減量化行動實施方案（2021—2025 年）》和2022 年畜牧獸醫(yī)工作要點等重要文件中要求加強獸用抗菌藥綜合治理，有效遏制動物源細(xì)菌耐藥。大腸桿菌耐藥性監(jiān)測工作一方面能準(zhǔn)確地掌握大腸桿菌耐藥性的發(fā)展趨勢，另一方面能為養(yǎng)殖場戶提供精準(zhǔn)用藥方案，避免抗生素亂用，推進(jìn)獸用抗菌藥減量化使用。

本次試驗監(jiān)測結(jié)果顯示，平邑7 家生豬養(yǎng)殖場的21 株豬源大腸桿菌對恩諾沙星的耐藥率為14%、中介率為29%、敏感率為57%；對慶大霉素的耐藥率為14%、中介率為14%、敏感率約為72%；對阿莫西林的耐藥率為100%；對氟苯尼考的耐藥率為71%、中介率為29%、敏感率為0；對多四環(huán)素的耐藥率為 43%、中介率為29%、敏感率為 29%；對黏菌素的敏感率100%。平邑地區(qū)生豬養(yǎng)殖場豬源大腸桿菌對阿莫西林耐藥性比較高，對恩諾沙星、慶大霉素比較敏感，對黏菌素敏感。不同生豬養(yǎng)殖場豬源大腸桿菌耐藥性不同，個別養(yǎng)殖場豬源大腸桿菌耐藥性很高，出現(xiàn)了多重耐藥性（對5 種抗生素耐藥）。為更有效落實獸用抗菌藥使用減量化行動，降低養(yǎng)殖場戶生豬養(yǎng)殖成本，建議平邑7 家生豬養(yǎng)殖場，根據(jù)藥敏結(jié)果，采用精準(zhǔn)用藥和輪換用藥方式來防治豬源型大腸桿菌疾病，避免抗生素亂用，進(jìn)一步推進(jìn)獸用抗菌藥減量化使用和獸用抗菌藥綜合治理。