9 株水貂銅綠假單胞菌的分離與鑒定

冷吉明，葛向平，劉長浩

（1.山東省膠州市里岔鎮人民政府，山東 膠州 266300；2.山東省膠州市動物疫病預防控制中心，山東 膠州；3.齊魯動物保健品有限公司，山東 濟南）

水貂出血性肺炎是一種主要由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染而引起水貂以口鼻流血、急性死亡為主要特征的急性細菌傳染病，是危害水貂養殖的重要疾病之一。該病在世界各地均有發生，我國是水貂養殖大國，由于養殖模式差異、管理水平差異、注射褪黑激素等原因，導致該病在我國呈現多年流行的情況。銅綠假單胞菌是引發水貂出血性肺炎的主要病原菌之一[1-4]，近年來也有報道其他病原菌引起水貂肺炎的病例。郭蕊、孫虎芝等報道了由肺炎克雷伯氏桿菌引起的水貂肺炎的病例[5-9]。于杰等報道了水貂出血性肺炎病例中存在銅綠假單胞菌與大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌等的混合感染[10]。但是銅綠假單胞菌仍然是造成水貂出血性肺炎，進而導致其死亡的主要病原。水貂的血清型眾多，目前研究發現，水貂中常見的血清型以G型、B型為主，極少有其他血清型感染的報道。趙志騰、葛愛民等曾分別在水貂出血性肺炎病例中檢測到C型、D型銅綠假單胞菌，但占比很低[11-12]，優勢血清型仍然是G型、B型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源及背景 病例來源于山東、河北、遼寧、黑龍江等23 個發生肺炎死亡的養殖場，發病死亡水貂均已注射褪黑激素，皮張在9～10 月份成熟銷售，其中8 個養殖場已經免疫出血性肺炎疫苗，15 個養殖場未免疫出血性肺炎疫苗。

1.1.2 試驗試劑 銅綠假單胞菌血清型鑒別抗體購自北京易購安生物技術有限公司，產品為日本生研株式會社生產；營養瓊脂、銅綠假單胞菌鑒別培養基、馬丁瓊脂和麥康凱瓊脂培養基，均購自中海生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；DNA Marker DL 2 000、2×Taq Master Mix，購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T 載體，購自TAKARA 公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養 解剖病死水貂，無菌采取肺臟，劃線接種于普通營養瓊脂平板上，并將平板置于37 ℃ 恒溫培養箱中培養14～18 h。

1.2.2 細菌分離與純化 挑取單個典型菌落，在普通營養瓊脂平板上做劃線培養純化，并挑取單個菌落接種于馬丁瓊脂、麥康凱瓊脂及銅綠假單胞菌鑒別培養基平皿上，37 ℃ 培養14～24 h，取單個菌落進行16s RNA 鑒定。

1.2.3 PCR 鑒定及遺傳進化樹分析 挑取培養基上直徑1～2 mm 單菌落，放入盛有100 μL 去離子水的1.5 mL 離心管內，沸水浴放置15 min。取出離心管并自然冷卻至室溫后，10 000 r/min離心5 min，取上清3 μL，用于細菌16s rRNA 的PCR 擴增。將擴增產物的測序結果與GenBank庫進行BLAST 比對，鑒定細菌種屬。16s rRNA引物（上游引物F：5’-GAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’；下游引物R：5’-ACGGCTACCTTGTTA CGACT-3’）。PCR 反應體系見表1，PCR 擴增條件：95 ℃預變性4 min 后；按照94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s 循環，設置30 個循環，最終72 ℃ 延伸10 min 后4 ℃ 保溫完成擴增，將擴增產物純化后送生物公司測序，將測序結果與GenBank 中相關細菌進行比對。

表1 . 細菌16s rRNA 的PCR 反應體系

1.2.4 血清型鑒定 將1.2.3 所鑒定的9 株銅綠假單胞菌進行血清型鑒定，采用銅綠假單胞菌標準血清進行平板凝集試驗。

1.2.5 細菌藥敏試驗 將經16s rRNA 鑒定的細菌，均勻涂布于普通營養瓊脂平板，按照NCCLS 推薦的K-B 紙片擴散法進行抗生素藥敏試驗及結果判斷。

2 結果

2.1 病原的分離純化結果

從23 個養殖場水貂肺臟分離純化出9 株細菌，細菌培養特性一致，在普通營養瓊脂平板上長出圓形、扁平、邊緣整齊的中等大小菌落，培養16 h 以上，菌落周邊培養基被染成黃綠色（圖1）。在銅綠假單胞菌選擇培養基平板上，可長出相同形狀大小的菌落，且整個菌落明顯呈藍綠色。12株細菌均為革蘭氏陰性小桿菌，呈單個或成對排列，偶爾呈鏈狀排列，染色形態一致（圖2）。

圖1 分離株在普通營養瓊脂生長照片

圖2 分離菌株革蘭氏染色照片

2.2 PCR 鑒定及遺傳進化樹

針對9 株分離的疑似銅綠假單胞菌進行16s rRNA 擴增分析，擴增片段大小均約為1 500 bp（圖3），擴增產物的測序結果為1 512 bp。經與GenBank 基因庫中序列比對發現，9 株分離株的序列與編號 AJ549293.1的“ P. aeruginosa AT10”、編號Z76651.1 的“P. aeruginosa LMG 1242T”銅綠假單胞菌序列一致性為 99.1%～100%（圖4），確定9 株分離株為銅綠假單胞菌。系統發育進化樹發現，WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 與P. aeruginosaAT10（ 編 號 ：AJ549293.1）、P. aeruginosa LMG 1242T（編號：Z76651.1）為同一分支（圖5），證實這9株分離株均為銅綠假單胞菌。

圖3 分離株16s rDNA 鑒定結果

圖4 WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 16s rDNA 同源性分析

圖5 分離株WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 16s rDNA 基因序列遺傳進化樹分析

2.3 血清型鑒定

將2.1 所鑒定的9 株疑似銅綠假單胞菌進行血清型鑒定，采用銅綠假單胞菌標準血清經平板凝集試驗（圖6）鑒定，結果顯示，9 株細菌分離株中7 株為血清型G型，2 株為血清型B型（表2）。

圖6 分離株平板凝集試驗

表2 9 株銅綠假單胞菌血清型鑒定結果

3 討論

水貂是我國特種養殖中重要的動物種類之一，多年來由于國內中小養殖場的養殖模式，在環境控制、飼料營養搭配等方面仍然存在一定不足，同時為了通過提前取皮，降低養殖成本，注射褪黑激素使水貂提前換毛，造成水貂出血性肺炎發病的加劇。山東及河北等地7 月初出現發病情況，而且發病持續期長達3 個月以上，這給本病的防控帶來較大挑戰。本研究中的15 個未免疫出血性肺炎疫苗的養殖場，肺炎發病率在5%～10%，病貂死亡率平均為41.6%，其中8 個養殖場病死貂中均分離到了銅綠假單胞菌；8 個免疫出血性肺炎疫苗的養殖場，肺炎發病率在0.5%～3%，病貂死亡率平均為28.5%，其中僅有1 個養殖場的病死貂中分離到銅綠假單胞菌，說明免疫出血性肺炎二價滅活疫苗能有效降低水貂死亡率。閆新武、趙志騰等曾分別報道，水貂免疫銅綠假單胞菌滅活疫苗對水貂出血性肺炎具有良好的免疫保護效果[13-14]。銅綠假單胞菌由于具有較強耐藥性，在對山東、河北、遼寧等地臨床調查發現，水貂養殖場分離的銅綠假單胞菌對臨床常見的β-內酰胺類、氨基糖甙類、大環內酯類、喹諾酮類、四環素類等抗生素均呈現不同程度耐藥性[15-17]，而且在肺炎發病高峰期，大劑量使用抗生素藥物，也會造成藥物中毒風險提高。有研究顯示，個別地區的銅綠假單胞菌分離株對中藥（五味子、烏梅）有較強敏感性，因此水貂養殖場在免疫出血性肺炎疫苗的同時，可選擇配合部分中藥制劑，進一步控制水貂出血性肺炎發病率，降低水貂死亡率，進而減少養殖場的經濟損失。

4 結論

本研究從發生水貂肺炎養殖場的病死貂肺臟中分離到9 株細菌，經PCR 鑒定和遺傳進化樹分析確定是銅綠假單胞菌，表明水貂出血性肺炎的主要病原仍然是銅綠假單胞菌；9 株銅綠假單胞菌經平板凝集試驗鑒定，其中7 株G型，2 株B型，表明目前造成水貂出血性肺炎的銅綠假單胞菌優勢血清型仍然是G型和B型，與目前臨床應用的水貂出血性肺炎二價滅活疫苗具有相同血清型。