一種過硫酸氫鉀復(fù)合物粉的消毒效果評(píng)價(jià)

黃學(xué)林，何金艷，齊長喜，吳秋萍，劉建柱*，馬保臣,2*

（1.江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司，江蘇 泰州 225300；2.中國牧工商集團(tuán)有限公司，北京；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安）

我國畜禽業(yè)的防疫工作始終貫徹“預(yù)防為主”的方針。消毒是畜禽業(yè)中非常重要的一項(xiàng)內(nèi)容，是畜禽養(yǎng)殖業(yè)確保實(shí)現(xiàn)生物安全的前提[1]。目前，化學(xué)消毒劑是畜禽業(yè)使用比較多的一種消毒劑，主要分為醇類、酸堿類、氧化劑類、鹵素類、醛類、酚類、表面活性劑類[2]，這類消毒劑刺激性較大、腐蝕性較強(qiáng)。

過硫酸氫鉀復(fù)合物粉是一種具有消毒效率高、使用范圍廣、安全且無毒等特性的復(fù)方消毒劑，已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖業(yè)[3]。過硫酸氫鉀復(fù)合物粉的作用原理是：溶于水后由鏈?zhǔn)椒磻?yīng)釋放出活性氧進(jìn)而形成羥基自由基、過氧化氫自由基等多種活性成分，使病原體蛋白質(zhì)變性凝固，產(chǎn)生的羥基自由基可以破壞 DNA、RNA 的磷酸二酯鍵，使病原體DNA 和RNA 的合成受到阻礙，從而起到消毒殺菌作用[4,5]。

本試驗(yàn)使用的過硫酸氫鉀復(fù)合物粉為粉紅色顆粒狀粉末，無刺激性氣味，有效氯含量不低于10%。目前過硫酸氫鉀復(fù)合物粉現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，只規(guī)定了其相關(guān)的理化指標(biāo)[6]，卻沒有能對(duì)禽養(yǎng)殖業(yè)的合理使用提供相關(guān)的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)[7]。因此，本研究通過試驗(yàn)摸索出過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)常見病原菌和病毒的殺滅效果、最低有效殺菌和殺毒濃度以及現(xiàn)場消毒效果，為其在畜禽養(yǎng)殖中的科學(xué)使用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株和細(xì)胞 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、摩根氏菌、沙門氏菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、禽白血病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型以及PK15 細(xì)胞，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉，有效氯含量不低于10%；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB 瓊脂培養(yǎng)基，購自青島高科技工業(yè)園海博生物有限公司；無菌脫纖維綿羊血、五水硫代硫酸鈉、胰蛋白酶，購自索萊寶科技有限公司；瓊脂糖凝膠粉末，購自科尚生物有限公司；50×TAE、DNA Marker（M116）、核酸染料，購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；病毒DNA/RNA 提取試劑盒、Evo M-MLV Plus cDNA 合成試劑盒、ApexHFHS DNA 聚合酶-CL、DNA Marker（AG11904），購自山東賽恩斯科技有限公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，購自賽維爾科技有限公司；引物（表1）的設(shè)計(jì)與合成，均由生工生物工程上海（股份）有限公司完成。

表1 本文中用到的病毒基因的引物序列

1.2 方法

1.2.1 消毒液和中和劑的配制 細(xì)菌滅活試驗(yàn)借鑒獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范（1992 年試行）[8]以及《GB15981-1995 消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)》[9]。在超凈臺(tái)內(nèi)，使用滅菌水將過硫酸氫鉀復(fù)合物粉按1:200 的濃度配制消毒液；用滅菌生理鹽水配制1%的硫代硫酸鈉溶液作為中和劑[10]。將PK15 細(xì)胞在含有10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃ 含有5%CO2的培養(yǎng)箱中生長。

1.2.2 定量殺菌試驗(yàn) 將細(xì)菌懸液稀釋至1.5×106CFU/mL。吸取0.5 mL 細(xì)菌懸液加入到無菌離心管中，再吸取4.5 mL 消毒液加入，混勻并計(jì)時(shí)，分別作用10、15、20、30 min，等達(dá)到反應(yīng)時(shí)間，向離心管加入1%硫代硫酸鈉進(jìn)行中和。陽性對(duì)照組：用滅菌水代替消毒液，其它同試驗(yàn)組。中和10 min 后，吸取樣品100 uL，分別接種至瓊脂培養(yǎng)基平皿和血瓊脂培養(yǎng)基平皿中，用無菌玻璃涂布棒將樣品均勻地涂布在平皿上，在37 ℃ 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。殺菌率=（初始菌落數(shù)-消毒后菌落數(shù)）/初始菌落數(shù)×100%。

1.2.3 定性殺菌試驗(yàn) 采用二倍稀釋法。在超凈臺(tái)內(nèi)，取5 支無菌離心管并編號(hào)，每管加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基4.5 mL，再在第1 管中加入按要求配制的消毒液4.5 mL，渦旋混勻，然后吸取4.5 mL加入第2 號(hào)管，如此倍比稀釋至第5 號(hào)管，第5號(hào)管中吸取4.5 mL 棄掉。消毒液濃度梯度為1:400 到1:6 400，然后按照1.2.2 中的方法將消毒液與細(xì)菌懸液處理后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以無菌落生長的平板所對(duì)應(yīng)的最小稀釋度的濃度為該消毒劑的最低殺菌有效濃度。

1.2.4 現(xiàn)場消毒試驗(yàn) 分別選擇墻壁、食槽、水槽、地面4 個(gè)位置，每個(gè)部位取3 個(gè)點(diǎn)作為取樣點(diǎn)，用蘸有無菌1%硫代硫酸鈉溶液的棉簽在各個(gè)取樣點(diǎn)上涂擦幾下，并將棉簽分別放入含10 mL 滅菌生理鹽水的離心管中，室溫浸泡30 min，作為對(duì)照。然后使用按要求配制的消毒液對(duì)墻壁、食槽、水槽、地面的取樣點(diǎn)進(jìn)行消毒。在消毒10、15、20、30 min 后，再分別對(duì)墻壁、食槽、水槽、地面4 個(gè)部位，每個(gè)部位取3個(gè)點(diǎn)取樣，然后將棉簽分別放入含10 mL 滅菌含有1%硫代硫酸鈉生理鹽水的離心管中，室溫浸泡30 min，作為待測樣品。然后按照1.2.2 中的方法對(duì)樣品做接菌培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。現(xiàn)場消毒殺菌率=（消毒前菌落數(shù)-消毒后菌落數(shù)）/消毒前菌落數(shù)×100%。

1.2.5 定量殺毒試驗(yàn) 在超凈臺(tái)中，向無菌試管中加入消毒液 4.5 mL，置于 20 ℃ 恒溫水浴5 min 后，加入0.5 mL 病毒懸液，立即混勻并計(jì)時(shí)，分別作用10、15、20、30 min。向各離心管加入中和劑（1%硫代硫酸鈉），中和10 min。陽性（病毒）對(duì)照組：用滅菌水代替消毒液，其它同試驗(yàn)組相同。將試驗(yàn)組和陽性（病毒）對(duì)照組的待測樣品分別接種于PK15 細(xì)胞，病毒液孵育2 h，然后使用PBS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3 次清洗，加入含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，最后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中（37 ℃，5% CO2）進(jìn)行培養(yǎng)48 h。48 h 后將細(xì)胞反復(fù)凍融3 次，4000 r/min，離心10 min，取上清待測。按病毒DNA/RNA 提取試劑說明書提取上清液中的病毒核酸，進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測，使用?mage J 軟件分析電泳條帶灰度。殺毒率=（陽性對(duì)照組電泳條帶灰度-試驗(yàn)組電泳條帶灰度）÷陽性對(duì)照組電泳條帶灰度×100%。

1.2.6 定性殺毒試驗(yàn) 按照1.2.3 中的方法對(duì)消毒液進(jìn)行二倍稀釋，然后將消毒液與病毒懸液處理后進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測。以瓊脂糖凝膠中沒有電泳條帶對(duì)應(yīng)的最小稀釋度的濃度為該消毒劑的最低殺毒有效濃度。

2 結(jié)果

2.1 定量殺菌結(jié)果

結(jié)果表明，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉在作用10 min 后，能夠完全殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、摩根氏菌和沙門氏菌；對(duì)鏈球菌和枯草芽孢桿菌也有較好的殺傷效果，30 min 殺菌率分別為99.9%和99.1%，結(jié)果見表2。

表2 定量殺菌結(jié)果

2.2 最低殺菌有效濃度測定結(jié)果

根據(jù)2.1 中的結(jié)果，在最大消毒劑配制濃度（1:200）條件下，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉也不能完全殺滅鏈球菌和枯草芽孢桿菌，因此本試驗(yàn)對(duì)其他幾種常見病原菌進(jìn)行了最低殺菌有效濃度測定。結(jié)果表明，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、摩根氏菌和沙門氏菌的最低殺菌有效濃度分別為1:3 200、1:3 200、1:800、1:1 600，結(jié)果見表3。

表3 最低殺菌有效濃度測定結(jié)果

2.3 現(xiàn)場消毒結(jié)果

結(jié)果表明，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉用于現(xiàn)場消毒10 min 后，對(duì)食槽、水槽、地面、墻面的細(xì)菌殺滅率在94%以上；消毒30 min 后，對(duì)食槽、水槽、地面、墻面等表面的細(xì)菌殺滅率達(dá)到99.9%以上，結(jié)果見表4。

表4 現(xiàn)場消毒結(jié)果

2.4 定量殺毒結(jié)果

由表5 可知，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉在作用10 min 后，對(duì)豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和禽白血病病毒均能起到完全殺滅作用；對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型殺滅效果較差。

表5 定量殺毒結(jié)果

2.5 最低殺毒有效濃度測定結(jié)果

根據(jù)2.4 的結(jié)果，在最大消毒劑配制濃度（1:200）下，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉也不能完全消殺豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型，因此對(duì)其他幾種病毒進(jìn)行了最低殺毒有效濃度測定。結(jié)果表明，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、禽白血病病毒最低殺菌有效濃度分別為1:1 600、1:3 200、1:3 200，結(jié)果見表6。

表6 最低殺毒有效濃度測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

由于過硫酸氫鉀復(fù)合物粉在配比上的差異，其消毒效果也存在差異[11-12]。因此，本文以某公司生產(chǎn)的過硫酸氫鉀復(fù)合物粉為研究對(duì)象，評(píng)估了其對(duì)常見病原菌和病毒的殺滅效果，還對(duì)其現(xiàn)場消毒效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

結(jié)果表明，該過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)常見病原菌和病毒有很好的消毒效果，且對(duì)革蘭氏陰性菌的殺滅效果比革蘭氏陽性菌好，這與劉元元等[11]的結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)該過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的消毒效果較差，可能與這兩種病毒對(duì)含氯消毒劑不敏感導(dǎo)致。紀(jì)知?jiǎng)俒13]和Shirai 等[14]研究表明，大部分消毒劑滅不了豬圓環(huán)病毒Ⅱ型，而豬繁殖與呼吸綜合征病毒更耐含氯消毒劑，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

本研究檢測出的過硫酸氫鉀復(fù)合物粉最低有效殺菌和殺毒濃度都比較低，并且該過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)食槽、水槽、地面、墻面表面的細(xì)菌有很好的消毒效果，這與劉元元等[10]的結(jié)果相似。較低的殺菌和殺毒濃度和較好的表面消毒效果有利于生產(chǎn)實(shí)踐中成本的控制和大規(guī)模應(yīng)用。

綜上所述，該過硫酸氫鉀復(fù)合物粉無刺鼻氣味，具有良好的溶解性和穩(wěn)定性，無論是對(duì)單種細(xì)菌或病毒，還是對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境均具有較好的消毒作用。