miRNA-184 與腎臟纖維化的相關性研究

陳彬，孫承斌，周建波，勵黎，韓利娜

腎臟纖維化是各種原因引起的慢性腎臟病（CKD）進展至終末期腎病（ESRD）的共同病理特征，包括腎小球硬化、腎小管間質纖維化和血管硬化。流行病學調查發現全球成人CKD 的患病率在10%以上，約1%的患者不可避免地發展為ESRD[1]。無論是各種原發性腎小球疾病，還是糖尿病、高血壓、輸尿管阻塞等繼發性腎臟病，腎功能的損害都與纖維化病變程度密切相關[2]。大量研究發現微小RNA（miRNA）與腎臟纖維化的發生發展密切相關。Krupa 等[3]發現在糖尿病患者腎組織活檢樣本中miRNA-192 表達下降。Kato等[4]發現，miRNA-192 通過抑制ZEBl/2而加速膠原合成，加劇基質沉積和腎小球硬化。本研究通過臨床觀察和動物實驗探討miRNA-184 與和腎臟纖維化之間的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月至2018 年10 月在寧波市鎮海區人民醫院行腎臟病理檢查的患者，將腎臟纖維化比例超過50%作為觀察組32 例，其中男15 例，女17 例；年齡（34.4±11.5）歲。將沒有腎臟損害，腎小球濾過率（CCR）＞90 ml-1· min ·1.73m-2，無腎臟影像學異常，無尿檢異常（沒有蛋白尿和或鏡下血尿）的患者作為對照組30 例，其中男14 例，女16 例；年齡（34.0±12.6 ）歲。兩組性別比、年齡差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。本研究經寧波市鎮海區人民醫院倫理委員會審批通過。

1.2 檢測miRNA-184 表達水平 抽取觀察組和對照組血清各3 ml，采用qRT-PCR 檢測miRNA-184表達水平。（1）Trizol 法提取血清中RNA，取血清樣本40l，加入Trizol裂解、離心、萃取、沉淀、洗滌，加入DEPC 水溶解RNA，分光光度計測定溶解情況。（2）反轉錄引物的設計及合成，引物的序列：5’-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGACGAGCTA-3’。（3）通過逆轉錄（RT）將RNA 轉化為cRNA。（4）通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增cRNA，使用的擴增引物。PCR 擴增引物1：5’-CGGCTGGACGGAGAACTGAT-3’，引物2：5’-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。

1.3 方法 將8 周齡雄性SPF 級C57 小鼠18 只（購自北京維利華實驗動物技術有限公司），分為3組，每組6 只。第1 組給予單側輸尿管結扎（UUO）造模，第2 組假手術，第3 組不予任何處理。（1）UUO造模：小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.004 ml/g 體質量）麻醉，取仰臥位固定小鼠，術前消毒，于無菌條件下，取腹部正中白線為手術切口。尋找左側輸尿管并鈍性分離輸尿管至腎門，于小鼠腎臟下極和腎門處分別用6/0 號絲線結扎左側輸尿管，并于兩結扎處之間剪斷輸尿管。右側輸尿管不予任何處理，縫合腹膜，消毒，縫合腹直肌和皮膚，再次消毒。（2）假手術：消毒麻醉均同前，取腹部正中白線為手術切口。僅尋找左側輸尿管并鈍性分離輸尿管至腎門，不予結扎左側輸尿管，同時右側輸尿管也不予任何處理。

1.4 病理切片及染色 1 周后處死小鼠取出腎臟組織，用4%甲醛溶液中固定、修塊、乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、切片（1 ～2m）、烤片、保存，用Masson 染色。

1.5 檢測小鼠腎臟中miRNA-184 表達水平 處死小鼠后留取1 g 左右腎臟組織做qRT-PCR 檢測，操作步驟同1.2。

1.6 統計方法 采用SPSS 18.0 統計軟件進行分析。計量資料用均數±標準差表示，兩組間比較采用t 檢驗，3 組比較采用方差分析；計數資料比較采用2檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miRNA-184表達比較 觀察組和對照組患者血清miRNA184含量分別為（3.13±0.34），（0.92±0.17），觀察組miRNA184含量高于對照組（t=40.81，P＜0.05）。

2.2 小鼠腎臟miRNA184 表達比較 3 組小鼠腎臟中的miRNA184 含量差異有統計學意義（P＜0.05），UUO 模型組腎臟中的miRNA184 含量高于假手術組和未處理組（均P ＜0.05），假手術組與未處理組差異無統計學意義（P ＞0.05），見表1。

表1 3 組小鼠腎臟miRNA184 表達結果比較

3 討論

miRNA 是一類長22nt 的非編碼RNA，通過靶向結合在目的基因的3’UTR 區域，轉錄后抑制其表達，進而調控下游一系列的基因表達，參與了機體內細胞發育、增殖、分化和凋亡等眾多生物學進程[5]。有文獻報道miRNA-184 通過調控系膜細胞自噬活性影響腎臟系膜細胞氧化損傷和衰老[6]。Liu等[7]通過miRNA芯片檢測和聚類分析發現在老年大鼠腎臟皮質miRNA-184、miRNA-150 和miRNA-132 的表達明顯高于青年大鼠，進一步實驗發現miRNA-184和miRNA-150可能通過共同作用于靶基因Rab1 和Rab31mRNA 從而在轉錄后抑制系膜細胞的自噬活性而調控系膜細胞衰老，腎臟衰老時伴隨著出現腎小球肥大、系膜基質增多，最后導致腎小球硬化和小管間質纖維化等。

本研究發現腎纖維化患者中miRNA184 含量高于對照組，推測miRNA-184 可能在腎臟纖維化過程中起到重要作用。為了進一步證實腎臟纖維化過程中miRNA 在腎臟組織中的表達情況，本研究制作了UUO小鼠模型模擬腎臟纖維化的過程，結果發現左側腎臟（結扎輸尿管這側）纖維化的特征明顯（纖維化的比例超過50%），右側腎臟無明顯病變，代表造模成功，并且發現UUO模型小鼠腎臟組織中的miRNA-184表達量明顯高于假手術小鼠和未處理小鼠，推測miRNA-184 與小鼠腎臟的纖維化過程有密切聯系。

Zanchi 等[8]通過抑制靶標LPP3，建立了miRNA-184 與糖尿病腎間質纖維化的聯系，LPP3 在調節參與多器官纖維化的脂質磷酸鹽的生物合成和細胞信號轉導[9]中起著關鍵作用。本研究并未證實miRNA-184 和腎臟纖維化之間的因果關系，也未涉及miRNA-184 是通過何種機制導致腎臟的纖維化，這些問題均要在今后的實驗研究中一步探索。