檳榔堿對口腔黏膜上皮細胞自噬和凋亡的影響

朱冰玉，蔣琪

口腔黏膜下纖維性變（OSF）是一種慢性炎癥疾病，可影響口腔黏膜的任何部位，被認為是一種嚴重的潛在惡性口腔疾病。OSF 病理是以慢性炎癥和萎縮性上皮為特征的病理損害，伴隨結締組織膠原纖維的異常堆積和血管狹窄或者閉塞為特征[1]。咀嚼檳榔已被認為是OSF 發病的主要病因，檳榔堿作為檳榔的重要成分之一，己經被證實是OSF 發病的主要病原性因素[2]。OSF 大鼠模型顯示檳榔堿溶液長期局部應用導致上皮萎縮，成纖維細胞的增殖和膠原纖維的堆積，最終導致OSF[3]。口腔黏膜出現上皮萎縮后，黏膜的保護性屏障消失，檳榔堿等致癌因子容易滲入變薄的上皮，與上皮下層甚至基底細胞相互作用，使其發生惡變。

自噬和細胞凋亡是程序性細胞死亡（PCD）的兩種形式，許多研究表明它們之間存在復雜的關系[4]。最近已有研究表明在檳榔堿處理的人口腔成纖維細胞中，自噬可通過上調TGF- 來誘導細胞膠原分泌增加[5]，但檳榔堿能否誘導OSF 中上皮細胞的自噬與凋亡目前仍不明了。角質形成細胞是上皮的主要構成細胞，數量占上皮細胞的80%以上，因此本研究檢測檳榔堿對人口腔角質形成細胞（HOKs）中自噬相關蛋白LC3、P62 和凋亡相關蛋白Caspase-3 表達差異，以及細胞凋亡情況，探討檳榔堿誘導HOKs 細胞自噬和凋亡的影響，并探討其作用，為OSF 上皮組織病變的發病機制和治療提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗細胞、試劑與儀器 HOKs 購于美國培養物保藏所（American type culture collection,ATCC），檳榔堿（購自美國Abcam 公司）、MTT（美國Sigma 公司）、兔抗人LC3 單克隆抗體和Caspase-3 兔抗鼠多克隆抗體（購自美國CST 公司）、兔抗人P62 單克隆抗體和-actin 鼠抗鼠單克隆抗體（購自美國proteintech 公司）、胎牛血清（購自美國Gibco 公司）、DMEM養基（購自美國HyClone 公司）、細胞凋亡檢測試劑盒（購自江蘇凱基生物）、BCA protein assay kit（購自美國Thermo Fisher）、細胞流式細胞儀（購自美國BD 公司）、SDS-PAGE 垂直電泳儀（購自美國Bio-rad 公司）。本研究經中南大學湘雅醫學院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 細胞培養與傳代 HOKs 在含有10%FBS、青霉素和鏈霉素的DMEM 培養基中培養，將HOKs 接種于培養基輕輕吹打混勻后，放入37 ℃、5%CO2和潮濕的培養箱中連續培養，隨時注意細胞的生長狀況。

1.3 MTT實驗 將HOKs接種到96 孔培養板中并且每孔大約1×104個細胞。（1）加入含檳榔堿濃度分別為0、7.5、15、30、60 和120g/ml 的培養基，各組均設5 個復孔，培養24 h。（2）小心倒掉舊培養液，向每個孔中加入5 mg/ml MTT 和200l DMSO，分別在恒溫箱中培養4 h。（3）記錄490 nm 在酶標儀測量的吸光度。

1.4 評估不同時間檳榔堿對HOKs 的影響 實驗分別用含15g/ml 檳榔堿培養液培養HOKs 至0、3、6、12 和24 h。

1.5 Western blot 檢測LC3、P62 和Caspase-3 蛋白表達水平 各組HOKs 細胞用冰浴后的PBS 沖洗細胞2 次，用RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。經SDS-PAGE 電泳、切膠、轉膜和封閉。用TBST 稀釋抗體，分別按照LC3（1∶1000）、Caspase-3（1∶1000）、P62（1∶1 000）和-actin（1∶5 000）配制一抗，孵育1 ～2 h。然后將NC 膜與兔二抗（1∶6 000）和鼠二抗（1∶5 000）一起，室溫孵育90 min。顯色和曝光后通過Quantity one軟件分析蛋白質的相對量，并將-actin設置為對照蛋白。

1.6 流式細胞術檢測HOKs細胞凋亡 收集處理后的細胞（每組細胞數約1×105個），37 ℃下用離心機2 000 r/min 離心5 min。向每組樣本中依次加入5l Annexin V-FITC 后，再加入5l PI 充分混合，在黑暗中反應15min。滴注200l 的Bindingbuffer，并在1h內使用BD FACSCalibur 流式儀檢測細胞凋亡率。

1.7 統計方法 采用SPSS22.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析（one-wayANOVA），P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度檳榔堿對HOKs 細胞活力的影響MTT檢測發現檳榔堿以劑量依賴性方式抑制HOKs細胞活力，并且檳榔堿的抑制作用隨著濃度的增加而增加。由于15g/ml 的檳榔堿處理的細胞顯示出接近50%的抑制，因此該劑量用于進一步實驗，見圖1。

圖1 MTT 法檢測HOKs 細胞活力

2.2 HOKs自噬相關蛋白LC3 和P62 的表達 15g/ml的檳榔堿刺激HOKs，結果顯示LC3-I 至LC3-II 轉化水平隨著時間的增加而上升（均P＜0.05），而P62的表達隨著時間的增加而下降（P ＜0.05）。 -actin為陽性對照，0 h 為陰性對照，見圖2。

圖2 HOKs 自噬相關蛋白LC3 和P62 的表達

2.3 HOKs 凋亡相關蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表達 用15g /ml 的檳榔堿刺激HOKs，結果顯示細胞中Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表達隨著時間的增加而上升（P ＜0.05），見圖3。

圖3 HOKs 凋亡相關蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表達

2.4 HOKs 細胞凋亡率 0 h 組的細胞凋亡率為（3.64±0.65）%，3 h 組的細胞凋亡率為（3.98±0.84）%，6 h組的細胞凋亡率為（4.87±0.96）%，12h 組的細胞凋亡率為（6.23±1.35）%，24h 組的細胞凋亡率為（7.65±2.26）%，檳榔堿能夠刺激HOKS 細胞發生凋亡，并且凋亡率隨著時間的增加而上升（P ＜0.05），見圖4。

圖4 流式細胞術檢測HOKs 細胞凋亡率

3 討論

咀嚼檳榔習性是OSF 的主要病因，而檳榔堿是檳榔中含量最豐富的生物堿，對人口腔上皮細胞和成纖維細胞具有細胞毒性，能夠增加DNA 鏈斷裂，微核形成，提高基因突變和提高染色體畸變[6]。上皮組織作為口腔黏膜最外層的保護屏障，受到檳榔的長期刺激，首先引起上皮細胞的變化，受損的上皮細胞釋放出多種細胞因子，通過一系列的信號轉導途徑使得成纖維細胞膠原蛋白分泌增加，膠原降解減少，從而導致纖維化形成。并且固有層膠原纖維堆積，將導致血管閉塞，加重上皮層缺血、缺氧和營養供給障礙，形成惡性循環[7]。本研究結果顯示，隨著檳榔堿濃度的增加，HOKs 的細胞增殖能力逐漸下降，進一步證實檳榔堿對上皮組織的損傷，促進了OSF 的發生發展。

凋亡，又稱I型程序性細胞死亡，是機體清除衰老及異常細胞來維持組織器官穩定的過程[8]。在凋亡過程中，活化的半胱天冬酶（Caspase）能夠切割多種底物，通過一系列的信號傳導途徑最終導致細胞凋亡的形態學變化[9]。Caspase-3 是其中最關鍵的蛋白酶，一旦通過外源性（死亡配體）和內源性（線粒體）途徑被啟動，凋亡便不可逆轉[10]。本研究發現檳榔堿刺激HOKs后，凋亡相關蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表達及凋亡率均隨著檳榔堿作用時間增加而逐漸上升，說明檳榔堿呈時間依賴性誘導HOKs細胞凋亡。Chang 等[11]研究也表明，檳榔堿通過阻滯S 期和G2/M 期的細胞來抑制上皮細胞的增殖，從而破壞上皮組織的修復過程。因此，筆者推測上皮細胞凋亡增加和抑制細胞增殖可能是上皮萎縮的潛在發病機制，而這一過程與檳榔堿的細胞毒性有關。

自噬，又稱II型程序性細胞死亡，是對胞內異常大分子物質和細胞器的自我降解和再循環的過程，因此自噬對于維持真核細胞中的細胞代謝和體內平衡至關重要。最近的研究表明，自噬在上皮細胞的生存和死亡中起著關鍵作用，并且在纖維化相關疾病中受到越來越多的關注[12]。Li 等[13]的研究表明，自噬在OSF中起重要作用，抑制自噬可以促進成纖維細胞的凋亡，同時減少膠原纖維的合成。然而，自噬在OSF 上皮組織中的作用尚不明確。LC3 是形成自噬體必不可少的蛋白，Atg4 內肽酶切割LC3 以轉變成LC3-I。在哺乳動物中，LC3-I 可以通過與磷脂酰乙醇胺偶聯形成LC3-II，始終存在于自噬體的內外膜上[14]。P62 也是自噬標志性蛋白之一，具有多種細胞功能，對于細胞信號轉導、蛋白質和細胞器的降解十分重要。P62 蛋白與泛素化的蛋白結合形成復合物，轉運至自噬體中作為底物被降解[15]。當自噬發生時，自噬體中的P62 蛋白被降解減少，而自噬受到抑制時P62 逐漸累積增多。因此，本研究選用LC3 和P62 作為反應自噬活性的相關蛋白。Western blot 檢測結果顯示LC3-II/LC3-I 比率隨著檳榔堿刺激時間的增加而增加，P62 的表達隨著檳榔堿刺激時間增加而逐漸下降，說明檳榔堿呈時間依賴性誘導HOKs發生自噬。

自噬和細胞凋亡是生物體內兩個重要的分解代謝過程，有助于維護細胞和組織的體內平衡。自噬是更新異常大分子物質和細胞器的主要機制，而細胞凋亡是將不需要的細胞胞內物質吞噬，并從生物體中消除的主要機制。盡管這兩種途徑之間存在顯著差異，但它們在確定細胞命運方面具有高度相關性，既能夠互相拮抗促進細胞生存，也能夠互相協同共同促進細胞死亡[16]。本研究發現凋亡相關蛋白的表達及凋亡率均與自噬活性的表達相同，隨著檳榔堿作用時間的增加而上升。著說明自噬和凋亡均與OSF發生發展相關，可能有協同作用。筆者推測檳榔堿長時間刺激口腔黏膜，導致更高的細胞毒性作用于外層上皮細胞，使得自噬活性升高，促進細胞顯著凋亡。

總之，本研究表明檳榔堿可以誘導HOKs 的細胞凋亡和自噬，但確切的機制仍有待進一步研究。筆者認為研究檳榔堿對上皮細胞的自噬和凋亡對OSF的發病機制有重要意義，可以通過抑制自噬和凋亡從而緩解檳榔堿對上皮細胞的影響，為進一步探討OSF 上皮萎縮的病因和治療提供新的思路。