獸用中藥化學(xué)對(duì)照品的研究思路與展望
——以甘草苷為例

張 璐,范 強(qiáng),龔旭昊

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分為標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、對(duì)照藥材、對(duì)照提取物和參考品等五類(lèi)[1],目前,獸用中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有化學(xué)對(duì)照品和對(duì)照藥材供應(yīng),其中化學(xué)對(duì)照品原料多從天然產(chǎn)物中提取精制而成,特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜、制備困難、標(biāo)定難度大。甘草苷是中藥甘草的主要有效成分,也是評(píng)價(jià)甘草質(zhì)量的指標(biāo)性成分,在《中國(guó)獸藥典》(2015年版)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)獸藥典)中用于甘草及含甘草制劑的含量測(cè)定等[2],在獸用中藥產(chǎn)品檢驗(yàn)、科研及新藥研發(fā)中應(yīng)用廣泛。本文擬以首批甘草苷獸用中藥對(duì)照品為例,分析獸用中藥對(duì)照品在標(biāo)定賦值過(guò)程中遇到的常見(jiàn)問(wèn)題,提出相應(yīng)的解決方法,為獸用中藥化學(xué)對(duì)照品的標(biāo)定和使用提供思路和技術(shù)支持,并對(duì)未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行展望。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Waters e2695 高效液相色譜儀,配置Waters 2489 雙通道紫外檢測(cè)器、Waters 2998 二極管陣列檢測(cè)器(PDA)、Empower2色譜工作站軟件;電子分析天平:感量0.00001 g;紫外分光光度計(jì);傅里葉紅外光度計(jì);干燥箱;高溫爐;卡氏水分測(cè)定儀;CAMAG REPROSTAR 3成像系統(tǒng)等;雙槽展開(kāi)缸;硅膠 G 薄層板 (10 cm×20 cm);乙腈,色譜純,購(gòu)自默克公司;甲醇、冰醋酸等試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司;水由實(shí)驗(yàn)室 MILLI-PORE 超純水儀自制。

1.2 試藥 甘草苷原料(批號(hào)ZQ1908017)由天津正清生物科技有限公司從豆科植物甘草Glycyrrhiza glabra L. 的干燥根和根莖經(jīng)提取、分離、純化制得;甘草苷對(duì)照品(批號(hào)111610-201908)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

天然產(chǎn)物中化學(xué)成分?jǐn)?shù)量繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,相同分子式的化合物還存在立體異構(gòu)、構(gòu)造異構(gòu)等現(xiàn)象。由于獸用中藥化學(xué)對(duì)照品從天然產(chǎn)物中提取精制獲得,為確保對(duì)照品源頭準(zhǔn)確,結(jié)構(gòu)鑒定工作尤為重要。獸用中藥化學(xué)對(duì)照品均為已知化合物,通常結(jié)合紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、1H NMR、13C NMR等譜學(xué)測(cè)試分析。甘草苷為二氫黃酮類(lèi)化合物,結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單(圖1),因此,研究中采用紫外光譜鑒別、紅外光譜鑒別,同時(shí)結(jié)合氫譜、碳譜,對(duì)甘草苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。對(duì)于一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的成分,仍需進(jìn)一步的譜學(xué)分析。例如地榆皂苷Ⅰ、通光散苷A、巴戟天寡糖5聚糖等三萜皂苷、甾體皂苷和寡糖等類(lèi)成分,還需要結(jié)合2D NMR(HSQC、HMBC、1H-1H COSY)、NOE、NOESY等核磁技術(shù),以準(zhǔn)確鑒定糖苷鍵連接位置及構(gòu)型等信息[3]。又如一些黃酮碳苷類(lèi)成分夏佛塔苷等,由于結(jié)構(gòu)中碳碳鍵旋轉(zhuǎn)位阻,導(dǎo)致其常溫核磁氫譜信號(hào)缺失,難以進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,需采用升溫核磁技術(shù),通過(guò)升高測(cè)定溫度,降低碳碳單鍵旋轉(zhuǎn)能壘,從而獲得清晰的氫譜信號(hào)以進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[4]。

中國(guó)堅(jiān)持打開(kāi)國(guó)門(mén)搞建設(shè)。開(kāi)放已經(jīng)成為當(dāng)代中國(guó)的鮮明標(biāo)識(shí)。中國(guó)將堅(jiān)定不移奉行互利共贏的開(kāi)放戰(zhàn)略，將始終是全球共同開(kāi)放的重要推動(dòng)者、世界經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的穩(wěn)定動(dòng)力源、各國(guó)拓展商機(jī)的活力大市場(chǎng)、全球治理改革的積極貢獻(xiàn)者。為進(jìn)一步擴(kuò)大開(kāi)放，中國(guó)將在激發(fā)進(jìn)口潛力、持續(xù)放寬市場(chǎng)準(zhǔn)入、營(yíng)造國(guó)際一流營(yíng)商環(huán)境、打造對(duì)外開(kāi)放新高地、推動(dòng)多邊和雙邊合作深入發(fā)展方面加大推進(jìn)力度。中國(guó)國(guó)際進(jìn)口博覽會(huì)不是中國(guó)的獨(dú)唱，而是各國(guó)的大合唱。

圖1 甘草苷結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Structure diagram of Liquiritin

本文60例胸腹部占位性病變患者的收治時(shí)間為2017年9月—2018年9月，其中男性觀察對(duì)象30例，女性觀察對(duì)象30例，年齡27～78歲，平均（55.6±5.6）歲。均通過(guò)超聲、CT技術(shù)予以確定，為多發(fā)或單發(fā)胸腹部占位性病變。其中44例胸部穿刺（縱膈穿刺4例，肺部穿刺40例）、16例腹部穿刺（11例腎穿刺，5例肝穿刺）。均簽署研究同意書(shū)；通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

3 純度分析

獸用中藥化學(xué)對(duì)照品純度分析采用薄層色譜法與高效液相色譜法相結(jié)合方式。在薄層色譜法分析純度試驗(yàn)中,應(yīng)充分考察供試品的量、展開(kāi)條件及顯色方式,以準(zhǔn)確檢出雜質(zhì)斑點(diǎn),并采用主成分自身對(duì)照法,對(duì)雜質(zhì)量進(jìn)行初步判定。高效液相色譜法中,由于紫外、熒光、示差折光等檢測(cè)器的非通用性,通常采用面積歸一化法或主成分自身對(duì)照法進(jìn)行純度分析檢測(cè)有機(jī)雜質(zhì)含量[8]。若化合物無(wú)紫外吸收,可使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行純度分析。

3.1 薄層色譜法檢查純度 在甘草苷原料薄層色譜法純度檢查試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)相同展開(kāi)條件下,顯色方式會(huì)影響雜質(zhì)檢出。取展開(kāi)后的薄層板,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視,可清晰檢出甘草苷主斑點(diǎn),無(wú)雜質(zhì)檢出。噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置日光下檢視,可檢出甘草苷主斑點(diǎn),也無(wú)雜質(zhì)檢出。又置紫外光燈(365 nm)下檢視,甘草苷主斑點(diǎn)顯色清晰,另檢出2個(gè)雜質(zhì)斑點(diǎn)(圖2)。

貧困地區(qū)一般集中連片，資源共享度較高，存在很大的合作空間。最好將幾個(gè)貧困村縣聯(lián)系起來(lái)總體規(guī)劃，在統(tǒng)籌發(fā)展的理念的制定下明確主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，并從中長(zhǎng)期的角度分析主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)劣勢(shì)、外部機(jī)遇及挑戰(zhàn)，系統(tǒng)地思考整片貧困地區(qū)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展策略，將扶貧產(chǎn)業(yè)納進(jìn)地區(qū)整體產(chǎn)業(yè)的發(fā)展框架，促進(jìn)協(xié)調(diào)各地區(qū)產(chǎn)業(yè)間的發(fā)展。

In ultraviolet light(365 nm) In daylight In ultraviolet light(365 nm)1,3,5-供試品溶液①(0.1 μg);2,4,6-供試品溶液②(10 μg)1,3,5-Sample solution①(0.1 μg);2,4,6-Sample solution②(10 μg)圖2 甘草苷原料薄層色譜圖Fig 2 The layer chromatogram of Liquiritin

照甘草苷原料薄層色譜鑒別方法,采用主成分自身對(duì)照,進(jìn)行雜質(zhì)初步測(cè)定。取甘草苷原料約50 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(5 mg/mL)。精密量取供試品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照溶液(0.5 mg/mL)。吸取對(duì)照溶液1 μL(0.5 μg)、2 μL(1 μg)、5 μL(2.5 μg)、10 μL(5 μg),供試品溶液20 μL(100 μg),點(diǎn)樣、展開(kāi)、晾干、顯色、檢視。供試品色譜中出現(xiàn)2個(gè)雜質(zhì)斑點(diǎn),其中1個(gè)雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色淺于對(duì)照斑點(diǎn)顏色(0.5%),另1個(gè)雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色與對(duì)照斑點(diǎn)顏色不同,無(wú)法比較深淺(圖3)。因此可初步判斷該批甘草苷原料至少含有兩種雜質(zhì),且一種雜質(zhì)量小于0.5%,但無(wú)法對(duì)雜質(zhì)量進(jìn)行判定,需要采用高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)定。

1-對(duì)照溶液0.5 μg(0.5%);2-對(duì)照溶液1 μg(1%);4-對(duì)照溶液2.5 μg(2.5%);6-對(duì)照溶液5 μg(5%);3,5-供試溶液100 μg(100%)1-Control solution 0.5 μg(0.5%);2-Control solution 1 μg(1%);4-Control solution 2.5 μg(2.5%);6-Control solution 5 μg(5%);3,5-Sample solution 100 μg(100%)圖3 甘草苷原料薄層色譜圖Fig 3 The layer chromatogram of Liquiritin

3.2 高效液相色譜法檢查純度 在甘草苷原料純度檢查試驗(yàn)中,使用等度洗脫和梯度洗脫兩種色譜條件進(jìn)行分析。取甘草苷原料10 mg置50 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。第一種色譜條件為:色譜柱Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.5%冰醋酸溶液;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm;進(jìn)樣量為10 μL;采集時(shí)間保留至甘草苷主峰保留時(shí)間的2.5倍,主成分峰與雜質(zhì)峰分離良好(圖4)。進(jìn)樣供試品溶液,并隨行檢測(cè)限溶液(0.2 μg/mL)。兩名試驗(yàn)人員分別進(jìn)行獨(dú)立的純度檢查,按面積歸一化法計(jì)算,均值為99.03%(n=4)。

圖4 甘草苷原料高效液相色譜圖(等度洗脫)Fig 4 The high performance liquid chromatogram of Liquiritin(Isotropic elution)

在化學(xué)對(duì)照品的研制、標(biāo)定過(guò)程中,世界衛(wèi)生組織(WHO)、美國(guó)藥典委員會(huì)(USP)、歐洲藥典委員會(huì)(EDQM)均采用質(zhì)量平衡法定值,即一個(gè)化學(xué)對(duì)照品的主成分、水分、有機(jī)溶劑、無(wú)機(jī)雜質(zhì)、有機(jī)雜質(zhì)含量的總和應(yīng)為100.0%[9],獸用中藥化學(xué)對(duì)照品也照此法定值,同時(shí)采用外標(biāo)法等進(jìn)一步佐證[10]。

圖5 甘草苷原料高效液相色譜圖(梯度洗脫)Fig 5 The high performance liquid chromatogram of Liquiritin(Gradient elution)

4 水分測(cè)定和殘留溶劑

3)習(xí)題模塊：實(shí)現(xiàn)效果如圖5所示。點(diǎn)擊答題選項(xiàng)后，如果答題錯(cuò)誤，則將錯(cuò)誤答案標(biāo)識(shí)成橙色、正確答案標(biāo)識(shí)成綠色且將解析顯示；如果答案正確，則直接加載下一題。點(diǎn)擊右上角，可以選擇題目和查看此試卷中自己的答題情況。

1.2.2 錄像觀察法 反復(fù)觀看首屆女籃亞洲杯中國(guó)隊(duì)與冠亞軍隊(duì)的比賽錄像，對(duì)3支球隊(duì)的每場(chǎng)比賽進(jìn)行觀察分析與統(tǒng)計(jì)，以提高所需數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從而歸納出每支隊(duì)伍在進(jìn)攻一端的技術(shù)特征。

甘草苷原料是甘草經(jīng)粉碎后有機(jī)溶劑回流提取,取提取液干燥粉碎,加入一定比例的有機(jī)混合溶液提取,收集提取液,加有機(jī)溶劑沉淀得固體,取濾過(guò)的固體用有機(jī)溶劑溶解后進(jìn)行硅膠柱層析,取洗脫液,濃縮后用乙酸乙酯反復(fù)重結(jié)晶,制備得甘草苷。制備所用溶劑乙酸乙酯沸點(diǎn)為77 ℃,在105 ℃可完全揮發(fā),因此可以通過(guò)測(cè)定干燥失重來(lái)替代殘留溶劑與水分之和。

不同菌株的孢子懸浮液接種4～5齡馬尾松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)后，其累積死亡率變化見(jiàn)圖1。從圖1可知，馬尾松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)接種不同菌株后的累積死亡率差異較大。接種白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株的累積死亡率較高，死亡速度也快，接種12 d后，馬尾松幼蟲(chóng)累積死亡率分別達(dá)到100%、90%，遠(yuǎn)比其他菌株高。接種20 d后，除白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株外，其他菌株的累積死亡率最高為66.7%(白僵菌BbTA-01)，最低僅為15%(綠僵菌MaMXTR-01)。

4.1 水分測(cè)定 照獸藥典二部附錄9001獸藥引濕性試驗(yàn)指導(dǎo)原則,測(cè)得甘草苷原料引濕增重為0.36%,表明其略有引濕性,在進(jìn)行水分測(cè)定時(shí)無(wú)需過(guò)多關(guān)注環(huán)境濕度。照獸藥典一部附錄0981結(jié)晶性檢查法檢查,甘草苷晶粒呈現(xiàn)明暗交替的物象,表明其有結(jié)晶性,在進(jìn)行水分測(cè)定時(shí),需關(guān)注樣品溶解情況。采用費(fèi)休氏法測(cè)得甘草苷原料水分均值為5.45%(n=2)。

4.2 干燥失重 照獸藥典二部附錄0831測(cè)定,兩名試驗(yàn)人員測(cè)得甘草苷原料減失重量均值為5.81%(n=4)。

5 無(wú)機(jī)雜質(zhì)

獸用中藥化學(xué)對(duì)照品無(wú)機(jī)雜質(zhì)參照熾灼殘?jiān)y(cè)定。對(duì)于無(wú)機(jī)鹽形式存在的樣品,還需結(jié)合更為準(zhǔn)確的離子色譜等技術(shù)測(cè)定無(wú)機(jī)離子實(shí)際含量[5]。甘草苷原料無(wú)機(jī)雜質(zhì)照獸藥典二部附錄0841測(cè)定,兩名試驗(yàn)人員測(cè)得熾灼殘?jiān)烤禐?.24%(n=4)。

水分一般采用卡氏水分測(cè)定儀費(fèi)休氏法測(cè)定,在應(yīng)用該方法時(shí),需特別關(guān)注樣品的引濕性和結(jié)晶性,避免因環(huán)境濕度高或樣品溶解不充分影響試驗(yàn)結(jié)果,即在測(cè)定極具引濕性的樣品時(shí),要注意環(huán)境除濕,避免環(huán)境濕度影響測(cè)定結(jié)果。若試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)結(jié)晶性樣品溶解不好,應(yīng)先研磨后再測(cè)定,以縮短滴定時(shí)間,保證結(jié)果準(zhǔn)確。已知原料的殘留溶劑種類(lèi)后,可采用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。如果樣品含未知?dú)埩羧軇?可以采用熱重分析—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用技術(shù)快速鑒定[9],該法可直接用于測(cè)定固定樣品,不但減少了有機(jī)溶劑的消耗,試驗(yàn)過(guò)程也更加簡(jiǎn)便、高效。

6 定 值

用另一種色譜條件對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。色譜條件為:色譜柱Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)—0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0～8 min,19%A,81%B;8～35 min,19→50%A,81→50%B;35～36 min,50→100%A,50→0%B;36～40 min,100→19%A,0→81%B);流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm;進(jìn)樣量為10 μL;采集時(shí)間保留至甘草苷主峰保留時(shí)間的2.5倍,主成分峰與雜質(zhì)峰分離良好(圖5),同時(shí)隨行檢測(cè)限溶液(0.04 μg/mL)。按面積歸一化法計(jì)算純度,均值為99.12%(n=2)。兩種色譜條件測(cè)得的純度值可互相印證。

根據(jù)《中藥化學(xué)成分提取分離手冊(cè)》[5]及相關(guān)文獻(xiàn)[6]記載,甘草苷在216 nm、276 nm和311 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。因此取甘草苷原料2 mg置100 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,照獸藥典二部附錄0401紫外—可見(jiàn)分光光度法檢測(cè),結(jié)果表明該批甘草苷原料在以上3個(gè)波長(zhǎng)處有最大吸收,與文獻(xiàn)資料記載一致。另采用溴化鉀壓片法,采集甘草苷原料和甘草苷對(duì)照品在4000～400 cm-1波段的紅外光譜圖,對(duì)二者進(jìn)行比較。結(jié)果表明二者的紅外光吸收?qǐng)D譜一致。在此基礎(chǔ)上,委托天津正清生物科技有限公司對(duì)甘草苷原料進(jìn)行了1H NMR和13C NMR譜學(xué)測(cè)試,將獲得的甘草苷原料核磁信息與已知文獻(xiàn)比對(duì),其數(shù)據(jù)與報(bào)道的化合物甘草苷(Liquiritin)信息一致[7]。綜上,認(rèn)為本批甘草苷原料來(lái)源準(zhǔn)確,確為甘草苷(分子式為C21H22O9,分子量M=418.39)。

6.1 質(zhì)量平衡法定值 用質(zhì)量平衡法對(duì)甘草苷原料定值,含量(%)=色譜純度×(100-干燥失重-無(wú)機(jī)雜質(zhì))/100,帶入數(shù)值,計(jì)算得甘草苷原料中甘草苷含量為(100-5.81-0.24)×99.00%/100=93.01%

6.2 液相色譜外標(biāo)法定值 甘草苷含量測(cè)定方法來(lái)源于文獻(xiàn)[6],因此增加了方法適用性試驗(yàn)。用PDA檢測(cè)器檢測(cè)甘草苷峰的純度,純度角度為0.031,純度閾值為0.227,純度角度小于純度閾值,說(shuō)明在該色譜條件下,甘草苷是單一物質(zhì)峰,且溶劑空白在與主峰相應(yīng)位置上無(wú)干擾,方法專(zhuān)屬性良好(圖6)。取甘草苷對(duì)照品10 mg,精密稱(chēng)定,置200 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,進(jìn)行6次測(cè)定,RSD值為0.3%,方法精密度良好。向甘草苷供試品溶液中精密加入甘草苷對(duì)照品,平行制備6份,計(jì)算回收率,測(cè)得的RSD值為0.94%,平均回收率為100.6%,方法準(zhǔn)確度良好(表1)。取甘草苷對(duì)照品適量,配制成系列濃度的溶液,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得甘草苷回歸方程(n=7):Y=19260X+40719.93,r=1.00,甘草苷在12.5～800 μg/mL濃度范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線性關(guān)系。采用信噪比法,以信噪比為3∶1時(shí)相應(yīng)濃度確定檢測(cè)限,以信噪比為10∶1時(shí)相應(yīng)濃度確定定量限,該色譜條件下,甘草苷的檢測(cè)限為0.2 μg/mL、定量限為0.6 μg/mL。照液相色譜條件,兩名試驗(yàn)人員各平行測(cè)定5份樣品,均值為93.10%(n=10),與質(zhì)量平衡法測(cè)得結(jié)果基本一致。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

a-溶劑空白溶液 b-供試品溶液a-Negative sample solution;b-Sample solution圖6 甘草苷原料高效液相色譜圖Fig 6 The high performance liquid chromatogram

7 討 論

獸用中藥化學(xué)對(duì)照品是獸用中藥材(飲片)、提取物、中成藥等檢驗(yàn)檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)研究、質(zhì)量控制的參比物質(zhì),用于判定獸用中藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣,對(duì)提高質(zhì)量控制水平、保障用藥安全有效具有重要作用,也影響著獸用中藥標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化發(fā)展。目前,還有很多獸用中藥材及其制劑無(wú)對(duì)照品供應(yīng),因此,制備高品質(zhì)的獸用中藥化學(xué)對(duì)照品以及進(jìn)行規(guī)范的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究具有較大的現(xiàn)實(shí)意義和學(xué)術(shù)價(jià)值。

獸用中藥化學(xué)對(duì)照品在未進(jìn)行標(biāo)定前需確定候選對(duì)照品,考察內(nèi)容有對(duì)照品的來(lái)源、制備工藝流程及相關(guān)參數(shù)等。同時(shí),采用紫外—可見(jiàn)分光光度法、紅外光譜法、質(zhì)譜法、核磁共振波譜法等對(duì)候選對(duì)照品原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。在此基礎(chǔ)上,采用薄層色譜主成分自身對(duì)照法、高效液相色譜歸一化法及主成分自身對(duì)照法檢測(cè)有機(jī)雜質(zhì)的含量,一般對(duì)照品原料要求純度不低于98.0%。定量用化學(xué)對(duì)照品采用國(guó)際通用的質(zhì)量平衡法賦值,再使用外標(biāo)法等進(jìn)一步佐證,以確保定值準(zhǔn)確。發(fā)放使用中一般不設(shè)有效期,通過(guò)定期監(jiān)測(cè)有關(guān)物質(zhì)及含量來(lái)確保對(duì)照品質(zhì)量。

定值是獸用中藥化學(xué)對(duì)照品研制的關(guān)鍵一環(huán)。通過(guò)分析質(zhì)量平衡法定值公式及標(biāo)定方法,可確定影響量值準(zhǔn)確性的因素主要為參與定值計(jì)算的相關(guān)標(biāo)定項(xiàng),即水分、殘留溶劑、無(wú)機(jī)雜質(zhì)、有機(jī)雜質(zhì)的量值。隨著定量分析技術(shù)發(fā)展,可通過(guò)試驗(yàn)引入水分、殘留溶劑、無(wú)機(jī)雜質(zhì)的不確定度,提高定值的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。然而當(dāng)原料中主成分與雜質(zhì)紫外校正因子差異較大或色譜峰間分離效果差時(shí),則無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定有機(jī)雜質(zhì)的含量[8],可能導(dǎo)致質(zhì)量平衡法與實(shí)際值偏離較大。因此在獸用中藥化學(xué)對(duì)照品定值中,常使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為溯源物,采用外標(biāo)法定量佐證。近年來(lái),有研究人員采用差示掃描量熱法(DSC法)驗(yàn)證對(duì)照品純度,即在程序控溫下,測(cè)量輸給物質(zhì)與參比物的功率差與溫度,基于熱動(dòng)力學(xué)原理度量總雜質(zhì)絕對(duì)含量定值對(duì)照品[11]。核磁共振(NMR)技術(shù)作為重要的有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)解析工具,不僅可以準(zhǔn)確獲取化合物結(jié)構(gòu)信息,還能依靠信號(hào)峰面積與產(chǎn)生信號(hào)的質(zhì)子數(shù)成正比的特性用于定量分析,已收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版[12]。有研究人員利用氫核磁共振定量(1H-quantative nuclear magnetic resonance,1H-qNMR)技術(shù),采用內(nèi)標(biāo)法應(yīng)用于化學(xué)對(duì)照品輔助定值[13]。

下一步,獸用中藥對(duì)照品當(dāng)根據(jù)實(shí)際使用需求不斷擴(kuò)大品類(lèi)覆蓋面,更好服務(wù)獸藥行業(yè)發(fā)展。綜合現(xiàn)狀,應(yīng)持續(xù)做好以下三方面工作。一是進(jìn)行化學(xué)成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。選取真正有效的活性成分為質(zhì)量控制關(guān)鍵成分來(lái)研制對(duì)照品,以質(zhì)量保障藥效。二是提升分析方法與技術(shù)手段。關(guān)注影響定值的關(guān)鍵因素并進(jìn)行充分評(píng)估,為質(zhì)量平衡法定值提出有效的技術(shù)要求。嘗試研究應(yīng)用定量核磁共振等新技術(shù),盡可能采用原理不同的定值方法相互佐證,確保結(jié)果準(zhǔn)確。三是利用好協(xié)作標(biāo)定這一賦值重要手段,可對(duì)協(xié)作標(biāo)定的組數(shù)、每組測(cè)定的次數(shù)、結(jié)果誤差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,制定更加科學(xué)規(guī)范的對(duì)照品研制辦法。