非甾體類抗炎藥前處理及檢測方法研究進展

孫志軒,李 苗,黃婧潔,錢思萱,顧雅妮,李建成*

(1.中國農業大學動物源性食品安全檢測技術北京市重點實驗室,北京 100193;2.中國農業大學動物醫學院,北京 100193)

非甾體類抗炎藥(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)是一類沒有甾體結構的抗炎藥,可以抑制環氧合酶(Cyclooxygenase, COX)以及其同工酶,從而阻斷前列腺素、白三烯和血栓素A的合成,達到了抗炎、抗風濕、減輕疼痛和退熱的作用[1]。NSAIDs是目前全世界獸醫和人類醫學中使用最為廣泛的藥物之一,全世界每天大約有3000萬人使用這類藥物。盡管NSAIDs是相對安全的藥物,帶來了許多益處,但其使用也可引起嚴重的副作用,其中胃腸道并發癥是最為常見的,除了嚴重的胃腸道損傷,藥物還可以引起腎臟毒性、肝臟毒性、心血管風險甚至是過敏性休克[2]。

隨著NSAIDs使用的持續增加,其藥物的安全性和副作用已成為目前全世界醫藥界關注的熱點問題。同時,也正因為NSAIDs是人類與動物臨床治療中最常用的藥物,其在世界各地的廣泛使用已導致其在水環境中無處不在,最近在許多研究中NSAIDs被認定為新出現的微量環境污染物[3]。在養殖場中,NSAIDs被廣泛用于治療動物的發熱、疼痛、炎癥、肌肉骨骼疾病以及與抗生素聯合用藥治療呼吸道疾病和奶牛的乳腺炎等。并有研究表明,NSAIDs能夠提高牛的生育能力,這些益處都使得NSAIDs在食品動物中被濫用[4]。NSAIDs在動物源性食品中的殘留對人類健康構成嚴重威脅,因此對食品中藥物殘留的分析監測具有重要意義。

目前國內外對動物源性食品中的NSAIDs殘留檢測技術報道較少,盡管一些NSAIDs已注冊為獸藥,但僅少數NSAIDs具有確定的最大殘留水平(Maximum Residue Limit, MRL)。各國NSAIDs的MRLs見表1。

表1 各國NSAIDs殘留限量標準Tab 1 MRLs for NSAIDs in various countries

檢測動物源性食品中的獸藥殘留需要進行樣品的前處理、檢測方法的建立和數據的分析驗證,以評估既定方法的穩定性、準確性和靈敏性。獸藥殘留分析技術的兩個主要部分是樣品制備的前處理方法和藥物殘留的檢測分析方法。第一部分樣品制備的前處理方法主要包括提取、凈化和濃縮。其中提取獸藥的方法有液液萃取、快速溶劑提取、固相萃取、固相微萃取、QuEChERS和基質分散固相萃取等。第二部分就是用于篩選或測定殘留物的檢測分析技術,進行定性定量分析的技術大致分為三種類型:微生物法,免疫學法和物理化學方法,包括酶聯免疫吸附法、免疫膠體金技術、熒光偏振免疫分析、生物傳感器技術、毛細管電泳、液相色譜、氣相色譜和液相色譜-質譜、液相色譜-串聯質譜等[5]。

1 NSAIDs樣品前處理方法

動物源性食品具有復雜的基質和許多內源性干擾物質,無法直接檢測獸藥殘留物。在樣品檢測之前,通常需要進行樣品前處理步驟,如提取、純化、蒸發或濃縮。因此樣品的前處理方法的創新也是當下藥物殘留分析研究的熱點[6]。

1.1 液液萃取(Liquid-Liquid Extraction,LLE) LLE是一種傳統的樣品預處理方法,包括溶劑萃取和超聲波振動介導萃取。LLE方法已被用于從動物源性食品中提取獸藥殘留物近十幾年。該方法操作簡單,在準備分離的液體混合物中加入一種與其不溶或部分互溶的液體溶劑,經過充分地混合,利用混合液中各種組分在溶劑中溶解度的差異,從而實現分離。但試劑耗量高、預濃度系數低、樣品制備時間長和所需樣品量高這些都是LLE方法的一些缺點[7]。2019年Zheng等開發了一種LLE結合液相色譜-串聯質譜(LC-MS)的檢測方法,檢測了鰻魚、比目魚和蝦中的的萘普生,回收率為70%～117%,相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)<9.3%,特異性、線性、準確性和精密度的驗證結果令人滿意[8]。2020年Di等開發了均相液-液微萃取(Homogeneous Liquid-Liquid Micro-Extraction, HLLME),此方法使得有機相和水相之間的接觸面積無限大。在分析之前,對水樣中的3種NSAIDs(包括酮洛芬、萘普生和托美汀)進行了富集和純化,該方法精密度高,回收率為97.2%～105.7%,比Zheng的方法準確性更高[9]。2022年Mashal等開發和驗證了LLE以同時定量檢測19種NSAIDs,回收率范圍為90%～106%,變異系數低于15%,該方法準確性好,但精密度沒有以上方法好,仍需進行優化[10]。

1.2 固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE) SPE因其卓越的分離效率和凈化能力而成為典型的提取方法。SPE是一種具有快速選擇性的樣品制備和純化技術,主要步驟為柱預處理、加樣、除去干擾雜質、目的分析物的洗脫和收集。SPE選擇性的基本原理與色譜相似,與傳統的LLE方法相比,SPE可以提高分析物的回收率,可以更有效地將分析物與干擾成分分離,并減少樣品的預處理,使其操作簡單,節省時間和精力[11-12]。SPE可以用于從肉、牛奶、雞蛋和蜂蜜等動物可食用組織中提取獸藥。此外,SPE也經常與LLE等其他方法結合使用,以便更好地富集和純化動物源性食品中的獸藥,是使用最廣泛的樣品前處理技術之一[13]。同時,SPE的效率在很大程度上取決于所用吸附劑的性質,因此,合成具有高吸收能力和選擇性的SPE吸附劑的新材料是研究的重點方向[14]。

2022年Hsen等人開發了一種磁性固相萃取(Magnetic-Solid Phase Extraction, MSPE)結合液相色譜-質譜(LC-MS)的分析方法,用于測定水樣中的5種NSAIDs。該方法中所有的NSAIDs平均回收率均在90%以上,RSD<17%,精密度良好[15]。2019年Han等制備了一種新型的磁性多孔碳用作MSPE吸附劑,用于測定環境水和生物樣本中的3種NSAIDs,并結合高效液相色譜(HPLC)使得該方法回收率為84.67%～113.73%,RSD<7.76%,準確性較高[16]。2018年Ma等合成了新型磁性納米顆粒用作MSPE吸附劑,從水樣本中提取8種NSAIDs,回收率為88.0%～108.6%,RSD<5.5%,準確性與重復性比Han所制備的方法表現的好[17]。2022年Liu等制備了新的復合材料以提高SPE的效率,結合HPLC從水樣本中提取NSAIDs,回收效率達到97.7%～105.1%,RSD<6.71%,該方法與以上方法相較,有出色的準確性與重復性[18]。

1.3 固相微萃取(Solid-Phase Micro-Extraction, SPME) SPME是從SPE衍生出來的一種無溶劑的樣品處理技術,最初由Belardi等人于1989年首次提出。利用萃取頭表面涂有特殊吸附材料,將待測物從水樣中吸附和解吸分離富集的技術,旨在解決SPE和LLE固有的局限性。SPME與LLE和SPE等傳統萃取技術相比,它具有易于使用,速度相對較快,易于自動化,便攜式,無溶劑等優勢[19]。但SPME與SPE相比仍然有一些缺點,SPME裝置的萃取成本較高,重復性較差,多次使用可能存在交叉污染等問題。

2018年Wang等建立了基于綠色深共晶溶劑制備了聚合物單片柱SPME,用于水樣中NSAIDs的檢測,回收率為84.5%～113.7%,RSD<4.32%,精密度較好[20]。2019年Ghorbani等建立了新穎的超聲波輔助SPME,結合HPLC來測定2種NSAIDs,這種方法成功地用于測定水、人類尿液和牛奶樣本分析物的檢測,實際樣本的平均回收率為103.7%,RSD<6.6%[21]。2019年Mirzajani等首次制備了涂有磁性納米復合材料的毛細管,并將其用作新型SPME纖維,用于測定生物液體中NSAIDs,平均回收率為94.0%～102.0%,RSD<4.7%,準確性與精密度與以上兩種方法比較表現優良[22]。

1.4 基質分散固相萃取(Matrix Solid-Phase Dispersion, MSPD) MSPD是Barker等于1989年首先提出的。作為一種快速樣品處理技術,其原理是將浸漬有C18等各種聚合物的單體SPE材料和樣品一起進行研磨,得到半干狀態的混合物,隨后將其作為填料裝進柱中,接著用不同強度的溶劑洗脫柱子,將各種目標待測物洗脫下來,MSPD適用于從單個樣品中提取多種藥物殘留物[23]。MSPD可以在簡單的環境條件下進行萃取過程,不需要任何特殊的實驗室設備,它比傳統技術具有優勢,只需要幾個簡單的步驟即可提取少量樣品和溶劑。因此,它被認為是一種簡單,快速,經濟,環保的方法。適用于食品,動物組織,植物材料和環境樣品。基于這些優點,MSPD方法被廣泛用于從動物源性食品中提取多種獸藥殘留物,但將其用于NSAIDs的殘留檢測的研究較少。

2017年Maria等開發了一種渦流輔助MSPD程序來提取母乳中NSAIDs,回收率為78%～86%,RSD<8.3%,精密度良好,仍需優化來進行呈現更好的精密度[24]。2016年Sara等優化了一種MSPD的提取方法測定了污泥中的五種NSAIDs,回收率84%～105%,RSD<4%,精密度較Maria建立的方法好[25]。

1.5 快速溶劑提取(Accelerated Solvent Extraction, ASE) ASE是一種在高溫和高壓條件下,使用有機溶劑提取的自動化方法。ASE作為一種新的提取程序,使用有機溶劑在更高的壓力和更高的溫度下提取固體或半固體。ASE方法的優點是有機溶劑含量小,速度快,基質效應低,回收率高,再現性好。與LLE和SPE方法相比,ASE具有操作簡單,速度快,樣品批量處理等優點,大大提高了效率,節省了時間[26]。隨著樣品制備技術的發展,自動化ASE方法正在推廣用于從動物源性食品中提取獸藥殘留。2019年Wolecki等在研究中,提出了一種ASE-SPE-GC/MS方法,用于同時測定貽貝中的5種NSAIDs。RSD在0.24%～7.85%,平均回收率在80%～118%[27]。

1.6 QuEChERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) 此提取方法廣泛用于動物源性食品中不同類型的獸醫藥物的殘留分析。其原理與HPLC和SPE相似,通過利用吸附填料和組織基體中的雜質之間的相互作用來吸附雜質,從而實現雜質去除和凈化。Anastassiades等人首先提出了QuEChERS方法,該方法可以提取極性和非極性化合物[28]。最初,QuEChERS方法是為從水果和蔬菜中回收農藥殘留物而開發的,但QuEChERS方法的有效性取決于實驗室中可用的目標分析物特性、基質組成、設備和分析技術。因此采用QuEChERS來檢測肌肉等肉類組織中的NSAIDs仍不是首選,所以研究較少。

2020年,孫建等建立了 QuEChERS定性篩查中藥材熊膽粉中169種獸藥殘留,其中包含13種NSAIDs[29]。2021年Ajibola等針對從污水中提取NSAIDs,優化了一種QuEChERS方法,結合HPLC進行了檢測分析。回收率為70%～118%,RSD<18%[30]。2021年Zapata等開發了一種QuEChERS分析方法,用于提取和量化條紋鯰魚肌肉中的NSAIDs,結合UPLC-MS/MS進行量化。其中雙氯芬酸的回收率為75%～102%,RSD<8.5%,精密度良好,但其余NSAIDs的回收率并不理想[31]。2016年Daniele等使用QuEChERS提取和LC-MS/MS對雙殼類中的NSAIDs進行多殘留分析,回收率為78%～117%,RSD<25%,精密度與準確性差強人意[32]。

2 NSAIDs殘留檢測方法

在樣品組織前處理結束后,通過殘留檢測分析技術來對動物源性食品中的目標分析物進行定性定量分析,目前已經開發了許多技術來檢測動物源性食品中的NSAIDs殘留。近年來常用的檢測NSAIDs殘留的方法有很多,包括液相色譜法、氣相色譜法、超高相液相色譜串聯質譜法、毛細管電泳法、酶聯免疫吸附法、傳感器技術、免疫膠體金技術。

2.1 液相色譜(Liquid chromatography, LC) LC是一種傳統、常見、高效和快速的色譜方法來檢測動物源性食物中的獸藥殘留。LC分離藥物的關鍵是選擇合適的色譜柱,并且優化流動相的組成和洗脫梯度。LC具有廣泛的適用性,可用于大多數獸藥殘留分析,并且可以與不同類型的檢測器進行結合,如:LC可以與熒光探測器(Fluorescence Detector, FLD)、二極管陣列探測器(Diode Array Detector, DAD)、紫外線探測器(Ultraviolet Detector, UVD)等特定檢測器進行結合。

不同類型的檢測器與LC相結合用于檢測相同類型或不同類型的獸醫藥物,并有其自身的優缺點。FLD是高度敏感和選擇性的探測器,只能檢測產生熒光的化合物。DAD和UVD主要用于檢測含有紫外線吸收基團的獸醫藥物,具有高靈敏度、低噪音和廣線性范圍的優點。

2021年Qiao等使用HPLC-UV方法測定4種NSAIDs。在最佳實驗條件下,該方法顯示出良好的線性,在5～2000 μg/L線性范圍內,R2為0.994～0.999,LOD為0.5～1 μg/L,LOQ為1～5 μg/L,RSD<12.86%,回收率為79.42%～107.52%[33]。2019年Hassan等用HPLC-DAD來確定人類尿液、唾液和牛奶中的4種NSAIDs殘留,線性范圍為0.13～100 μg/mL,LOD為0.04～0.18 μg/mL,LOQ為0.13～0.61 μg/mL,RSD<7.7%, 回收率為95.7%～109.2%,準確性與精密度良好[34]。

2.2 氣相色譜(Gas chromatography, GC) GC也是一種傳統、常用的色譜技術,主要使用化合物沸點、極性和吸附性能的不同點來分離混合物。為了分析動物源性食品中的獸藥殘留物,GC通常與經典探測器相連,主要包括的是氮磷探測器(Nitrogen phosphorus detector, NPD)、電子捕獲探測器(Electron Capture Detector, ECD)和質譜探測器(Mass Spectrometry Detector)。與NPD和ECD相比,MS或MS/MS具有良好的恢復性、準確性和可復制性,并可以確認假陽性。一般來說,GC檢測獸藥需要衍生反應,GC通常要求選擇特定的毛細管柱來分離樣本中的獸醫藥物,而不需要像LC方法那樣優化移動相位[35],但由于在對NSAIDs進行氣相色譜分析之前,必須先進行衍生步驟,以增加這些分析物因其酸性基團而產生的揮發性并降低極性。因此由于基質的復雜性以及NSAIDs提取和衍生反應占用的時間,通常GC不首選用于分析NSAIDs。關于GC用于檢測NSAIDs的研究報道較少,不過GC被廣泛用于農藥分析,也正在逐步開發用于NSAIDs殘留檢測的研究。

2020年Avino等研究了一種測定動物尿樣中NSAIDs的低溶劑消耗方法,并用GC-MS進行檢測分析,回收率為94.1%～101.2%,RSD為≤4.1%。線性范圍為1～100 ng/mL(R2≥0.995),LOD在0.1～0.2 ng/mL之間,LOQ在4.1～4.7 ng/mL之間,所提出的分析方法可重復,靈敏且簡單[36]。

2.3 超高效液相色譜-串聯質譜(Ultra-High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS) UPLC-MS/MS、HPLC和UPLC都是基于LC開發,將UPLC與FLD、DAD、UVD結合相比,MS可以同時檢測動物源性食物中的100多種獸醫藥物, 同時MS具有高回收率、高選擇性、良好的可重復性和低干擾性等優點。此外,串聯質譜的使用更是提高了敏感性,并在確認假陽性方面發揮重要作用[37]。

2.4 毛細管電泳(Capillary Electrophoresis, CE) CE是一種較新型的液相分離技術,以毛細管作為分離通道,高壓直流電場作為驅動力而進行檢測分析。CE具有許多優點,如效率高、樣品和緩沖劑消耗低以及速度快,是LC方法的潛在替代技術[42]。但是CE在樣品制備能力、靈敏度和分離再現性等方面有一定的限制,限制的原因是注射量小,毛細管直徑小,以及樣品成分引起的電滲透變化,并且由于注射量小進而導致靈敏度也低。所以許多研究將CE與一些高靈敏度檢測器相結合,包括UVD、DAD、MS探測器和化學發光探測器(Chemiluminescence, CL)[43]。

2017年Espina等開發了一種敏感的CE-UV方法用于分析水樣品中的NSAIDs,并進行識別和定量,這三種藥物的LOD在0.96～1.27 μg/L之間,LOQ在2.91～3.86 μg/L之間,回收率為95%～104%,RSD<13.3%,精密度良好[44]。

2.5 傳感器技術(Sensor Technology ) 隨著檢測技術的不斷發展,先進的傳感器主導的檢測技術已經出現,傳統的色譜技術與不同的探測器結合使用,增強了分析方法的靈敏度、特異性和可靠性。傳感器技術為檢測動物源性食品中的獸藥殘留物提供了一種快速、高效和具有成本效益的方法。但缺點是它們消耗了大量有機試劑,耗時且昂貴,不適合大量篩選樣本。該技術被用作檢測動物源性食品中獸藥殘留物的替代檢測方法,包括電化學生物傳感器、壓電生物傳感器、光學生物傳感器等的方法[45]。許多研究開發的傳感器分析方法不僅操作簡單、速度快、成本低,而且在動物源性食品中檢測獸藥的特異性、靈敏度和精密度方面也取得了令人滿意的效果。

2019年Tarahomi等用石墨烯氧化物修飾構建了一種新型一次性電化學傳感器,該光盤上裝飾有Ag納米顆粒和β-環糊精,用于定量測量溶液中的萘普生,其在 0.4～80 μmol/L的濃度范圍內是線性的。LOD為0.023 μmol/L,LOQ為0.08 μmol/L,回收率在98.5%～101.05%[46]。2020年Qian等報道了一種用于檢測萘普生的選擇性和靈敏的石墨烯氧化物電化學傳感器,電化學傳感器表現出廣泛的線性范圍(10 μmol/L～1 mmol/L),高靈敏度,在相同濃度下進行了多次測量平均回收率為96.9%,RSD為2.5%,LOD為1.94 μmol/L,LOQ為6.47 μmol/L,這些結果驗證了傳感器的準確電化學量化[47]。

2.6 酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno￣sorbent Assay, ELISA) ELISA是一種超微實驗檢測技術,基本原則是將特定的抗原抗體免疫反應與酶催化反應進行結合,并通過酶反應的放大顯示初級免疫反應。這種方法可以檢測抗原和抗體。ELISA具有操作簡單、方便、效率高、特異性強、檢測成本低的優點,廣泛用于檢測動物源性食品中的獸藥殘留。

目前,關于NSAIDs的免疫分析方法較少,主要是因為NSAIDs種類多,抗體制備復雜。2018年Lin等制備敏感的氟尼辛單克隆抗體用于開發IC-ELISA方法檢測牛奶中的氟尼辛殘留,單克隆抗體IC50為0.29 ng/mL,LOD為0.432 ng/mL,線性范圍為0.08664～0.97226 ng/mL[48]。2020年宋炎博制備了吲哚美辛的單克隆抗體,并進一步建立了鮮奶樣品中吲哚美辛的ELISA檢測方法。抗體IC50為275.05 ng/mL,LOD為2.19 ng/mL,LOQ為40.88 ng/mL[49]。

2.7 免疫膠體金技術(Immune Colloidal Gold Technique, GICT) GICT是一種新型的免疫標記技術,是以膠體金作為示蹤目標物應用于抗原及抗體的檢測。GICT是一種廣泛使用的免疫分析方法,具有分析時間短,肉眼可在10 min內獲得結果,以及易于執行和評估的優點。膠體金的物理性狀,如顆粒大小、高電子密度、形狀和顏色反應,加上結合物的免疫學及生物學的特性,因而使得GICT廣泛地應用于細胞生物學、免疫學、病理學、組織學等領域。

2020年Na等制備了針對卡洛芬的高親和力單克隆抗體,然后開發了用于快速篩選牛肌肉中NSAID的免疫試紙條,以幫助畜牧業強制遵守法規,制作的試紙條的陰陽性界限值為12.5 ng/g,分析牛樣品中的NSAIDs殘留物具有巨大潛力,IC50值為1.743 ng/g,LOD為0.283 ng/g,測量NSAID的線性范圍為0.446～6.804 ng/g,回收率為79.53%～90.55%,RSD<8.81%[50]。2021年Lin等開發了基于單克隆抗體的GICT,用于檢測牛奶中6種NSAIDs。6種NSAIDs的IC50為0.31～5.36 ng/mL,結果可在10 min內用肉眼獲得[51]。

3 小 結

目前國內外對動物源性食品中NSAIDs的殘留檢測相關報道很少,并且食品安全國家標準中檢測的組織樣品和NSAIDs的種類都相對單一。但NSAIDs種類繁多、使用廣泛,在環境和動物源性食品中的殘留情況愈加嚴重,難以滿足當前NSAIDs的監控需求。

本文重點介紹了NSAIDs在動物源性食品中的前處理方法和檢測方法,并比較了各種方法的優缺點。NSAIDs檢測方法的發展趨勢在儀器檢測方向應該進一步優化創新簡便、高效的前處理過程,減少樣品基質的影響。另外,在免疫分析方向,針對不同類別的NSAIDs,設計合成半抗原,制備廣譜識別性單克隆抗體,初步構建NSAIDs免疫分析抗體庫,建立并進一步完善NSAIDs及其代謝物的殘留檢測體系,以保證合理用藥,保障人類食品安全,促進畜牧業健康發展。