基于網絡藥理學探討治療乳難中藥共同代謝通路

沈冰芳,方 聰,徐小妹,張亞敏,盧雪花,李麗莎,徐榕青,林文津*

(1.福建中醫藥大學藥學院,福州 350001;2.福建省醫學科學研究院,福建省醫學測試重點實驗室,福州 350001)

哺乳動物的乳汁具有營養、免疫保護和信息傳遞等功能,充足的乳汁是新生動物生存和繁殖的前提,在人類生活成長中乳及乳制品也是主要的營養食物[1]。產后乳汁甚少,或逐漸減少,或全無,不能滿足哺乳的需要,稱為“產后缺乳”、“乳難”等[2]。中醫學認為乳汁為氣血所化生,氣血源于脾胃水谷精微所化,氣血充沛則乳汁充盈。因此,氣血虛弱、肝郁氣滯、痰濁壅滯及瘀血阻滯是本病的主要病機[3]。

目前的治療方案中,中醫藥治療產后缺乳療效肯定,在辨證體系和治療方法上都有較為成熟的經驗,理法方藥運用獨到,中醫藥治療此病的前景也越來越廣闊[4],中醫藥對缺乳的研究歷史悠久,積累了豐富的文獻資料,有很好的臨床療效,無不良反應,安全可靠[5],中醫治療以人為本,辨證論治為核心,通過中藥等治療方法從根本上幫助產婦解決缺乳問題[6]。在防治人畜疾病方面,中草藥自古以來被我國人民多有應用,具有純天然、無殘留、多靶點的優點,在眾多的中醫及中獸醫典籍中多具有催乳方藥的記載[7]。藥典中的增奶、催奶方劑已經被許多獸醫名家驗證并在臨床上普遍應用[8]。如徐靈胎《神農本草經百種錄》記載中藥材澤瀉可去除多種水氣之疾,而乳亦水,因此也可用于通乳[9]。在2020年版一部《中國藥典》中,關于治療乳汁分泌不足的中藥材多有記載,其中川木通、小通草、飛揚草、王不留行、木通、貫葉金絲桃、禹州漏蘆、通關藤、通草、黑種草子、漏蘆等均具有促進乳汁分泌的作用,在臨床上應用廣泛,但當前關于這些藥材成分的作用機制方面的研究較少。因此,本文利用網絡藥理學的方法探討乳難中藥共同代謝通路,為乳難中藥的開發奠定基礎。

網絡藥理學作為一門基于系統生物學、生物信息學和高通量組織學的全新學科,在實踐中,網絡藥理學的包括基于數據庫的研究網絡構建,網絡分析搜索關鍵化合物和靶點,以及實驗驗證以確保預測結果的可靠性[10]。網絡藥理學可以系統、全面地觀察藥物對疾病的影響,從而揭示中醫藥與疾病之間的復雜關系,網絡藥理學已成功用于揭示中藥在疾病治療中的潛在活性成分,靶點和機制。基于系統生物學和多藥理學的網絡藥理學被認為是闡明中藥多成分、靶點、協同效應和機制的有效工具,為提高藥物的臨床療效、降低毒性和闡明藥物的多機制提供有價值的信息[11]。本研究通過網絡藥理學方法,探討乳難中藥的靶點、活性成分,進一步了解治療該領域的藥理機制,促進臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1 藥材

1.2 活性成分及其靶點的篩選 應用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(http: ∥tcmspw.com/index.php)、中國知網檢索川木通、小通草、飛揚草、王不留行、木通、貫葉金絲桃、禹州漏蘆、通關藤、通草、黑草種子、漏蘆的所有活性成分。以口服生物利用度(OB) ≥30%,類藥性(DL)≥0.18為限制條件進行篩選,利用TCMSP靶點預測功能和Swiss target prediction查詢有效成分的作用靶點,然后將所得到的靶點信息用Uniprot數據庫(https: ∥www.uniprot.org/),限定物種為人類、牛、羊、豬,將所有靶點進行基因標準化。

表1 2020年版中國藥典中具有下乳或通乳作用的中藥材Tab 1 Chinese medicinal materials with lactation or lactation effects in the 2020 edition of the Chinese Pharmacopoeia

1.3 乳難疾病靶點的獲取 以“difficult lactation”、“lactation disorder”、“breast milk stoppage”為關鍵詞,使用GeneCards (http: ∥www.genecareds.org/)、OMIM (http: ∥www.omim.org/)數據庫中分別獲取乳難疾病的靶點,刪除不同數據庫合并后產生的重復基因信息,獲得所選活性成分潛在作用靶點。

1.4 藥物疾病交互靶點 將收集到的中藥靶點和乳難疾病靶點導入 Venny 2.1.0在線平臺進行分析,獲取“中藥-疾病”交互靶點信息,并繪制韋恩圖。

1.5 蛋白互作(PPI)網絡構建及關鍵靶點的篩選

將收集到的藥物-疾病共同靶點導入STRING數據庫(https: ∥string-db.org),選擇“Multiple proteins”,并將物種選擇為“Homo sapiens”,獲得蛋白與蛋白之間相互作用的數據,并將數據導入 Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化分析,繪制PPI 網絡圖,并利用其內置network analyzer分析工具分析網絡特征參數,包括連接度中心性(Degree centrality, DC)、緊密度中心性(Closeness centrality, CC)、介度中心性(Betweenness centrality, BC)進行關鍵靶點的篩選。

1.6 靶點GO功能與KEGG富集分析 Metascape平臺(http: ∥metascape.org)可對靶點進行通路富集分析,該平臺更新及時,整合了GO、KEGG、Uniprot等多個權威的功能數據庫,支持對批量基因或蛋白質進行注釋、富集分析及構建PPI 網絡,GO富集分析可分為細胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)三個部分。將關鍵靶點導入Metascape 平臺進行GO及KEGG分析,保存其結果并對其進行可視化。

2 結果與分析

2.1 藥物成分及靶點信息 通過各組分的ADME性質來篩選潛在的活性成分,結果獲得58個潛在活性分子(川木通3個、小通草2個、王不留行4個、木通8個、貫葉金絲桃6個、禹州漏蘆4個、通草3個、漏蘆5個、飛揚草14個、通關藤6個、黑草種子3個)。然后依次收集活性化合物及其對應的靶點信息,經過數據篩選找到其對應的靶點蛋白,刪除重復和無效值,得到336個藥物作用靶點。將藥物、藥物有效成分及靶點導入至Cytoscape 3.9.1中,構建藥物化學有效成分及預測靶點的關系網絡圖,如圖1所示。

2.2 乳難疾病靶點信息 根據GeneCards數據庫查詢靶點信息,共獲得4922個靶點,篩選score>6的基因靶點,結果為1513個,在OMIM數據庫中共檢索得到739個靶點信息。對各數據庫檢索結果進行合并,刪除重復靶點得到2175個疾病相關靶點。

2.3 藥物疾病交互靶點 將獲得的2175個乳難疾病靶點與藥物的1419個靶點進行匹配,使用Venny2.1.0軟件獲取兩者的交集靶點基因,即為化合物作用于疾病的交集靶點基因,構建“藥物-疾病”靶點韋恩圖,得到共有靶點158個,如圖2所示。

圖2 藥物-疾病靶點韋恩圖Fig 2 Venn diagram of drug-disease targets

2.4 蛋白質相互作用關系網絡的構建及關鍵靶點的篩選 將交集靶點導入String在線數據庫,進行PPI分析,獲得節點數158個,邊數2788條,平均節點度為35.3,平均局部聚類系數為0.581,利用Cytoscape3.9.1對PPI網絡進行可視化處理,得到PPI網絡圖(圖3),以節點的大小和顏色的深淺反映degree值的大小,節點越大、顏色越深,所對應的degree值則越大,則該節點在網絡中的地位越重要。根據cytoscape3.9.1中的CentiScape2.2進行關鍵靶點篩選,篩選得到Betweenness Centrality(147.8734),Closeness Centrality(0.0033),degree(35.2911)3個拓撲參數均大于所有節點中位數的靶點共計30個,即網絡的關鍵基因(表2)。

圖3 交集靶點的PPI網絡圖Fig 3 PPI network diagram of intersection targets

表2 拓撲分析30個核心靶點信息Tab 2 Information on the 30 core targets for topological analysis

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析 GO富集分析分為生物過程(BP,Biological Processes)、細胞組分(CC,Cellular Components)分子功能(MF,Molecular Functions)三大類。以P<0.01為篩選條件,共獲得GO富集分析條目1030個,包括生物過程947個,細胞組分29個,分子功能54個。篩選靠前10個進行可視化分析(圖4),其中BP種主要涉及細胞遷移的正向調節、細胞運動的正向調節、細胞成分運動的正向調節等,CC主要涉及對膜筏、膜微區、小窩等,MF主要涉及核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、轉錄協同調節因子結合等。

圖4 GO富集分析圖Fig 4 GO Enrichment Analysis Chart

以P<0.01為篩選條件,對30個靶蛋白進行KEGG通路富集,共富集到119條信號通路。根據P值大小篩選前20個繪制氣泡圖(圖5),主要涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig 5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

3 討論與結論

中醫中藥在治療乳汁分泌不足方面具有獨到之處,臨床治療重在疏肝理氣、補益氣血,兼顧活血祛瘀、通絡下乳等,目前臨床上有關于治療乳汁分泌不足的方法有中藥口服、中藥外敷、針灸和按摩等[14]。川木通性寒,味淡、苦,無毒,適用于慢性尿路感染、風濕性關節炎、喉痹失音、經閉乳少的治療;木通性涼,味苦,主治小便短赤、淋濁、水腫、遍身拘痛、婦女經閉、乳汁不通;通草用于濕熱淋證、水腫尿少、乳汁不下等癥,能使陽明經精氣生發上達而下乳汁,鄭濤[15]等針對通草增加哺乳期乳汁分泌的機制進行了研究;小通草治產后乳汁不足常與王不留行、黃蜀葵根同用[16];王不留行走陽明沖任,功善通利,長于通利血脈治療血脈不通之乳汁不下[17];飛揚草清熱解毒,收斂止癢還可治療痢疾、淋病、乳汁不足、乳癰、濕瘡等疾病[18];貫葉金絲桃常用于肝氣郁結,情志不暢關節腫痛,乳癰,乳少等[19];漏蘆可通經下乳,臨床常用于治療乳癰腫痛和乳汁不下等癥,為治療乳癰、產后缺乳之良藥[20];禹州漏蘆《滇南本草》記載其味甘、平,性寒,治乳結紅腫硬痛,乳汁不通,乳癰乳巖,攻癰瘡[21];黑種草子維吾爾醫臨床將其用于胸悶氣促、乳腫、耳鳴和乳汁減少等病癥的治療[22];通關藤又稱為奶漿藤、下奶藤,多用于痰多咳喘、風濕腫痛、瘡癰以及產后乳汁不通等癥[23]。因此中藥在治療乳汁分泌不足方面有良好的效果,但其成分數百種,對其成分和機制的研究還較少,本研究通過網絡藥理學系統分析了11味治療乳難中藥的有效成分,構建化合物-靶點網絡,分析化合物與靶點的相互作用關系。

通過對藥物有效成分進行篩選,共獲得58個關鍵成分,其中化合物-靶點網絡中的關鍵成分是β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、槲皮素、咖啡酸、松脂酚等。根據PPI網絡拓撲學分析預測AKT1、TP53、TNF、IL6、CASP3、IL1B、VEGFA、ESR1、MYC、EGFR等為治療乳汁分泌不足的潛在關鍵靶點, AKT1是3種密切相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2 和AKT3)之一,稱為 AKT 激酶,可調節包括代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成在內的許多過程。AKT1對于調節乳腺中催乳素的合成和分泌有重要作用。ESR1基因在機體性發育以及生殖功能方面發揮顯著作用,當其與雌激素結合后可通過乳腺細胞分泌生長因子途徑來影響乳腺發育情況,另外ESR1基因具有促進細胞分裂、繁殖和生長能力[26]。

GO富集分析表明,促進乳汁分泌中藥材的靶點存在于多種細胞成分,通過KEGG通路富集分析發現,促進乳汁分泌涉及多種通路,一部分基因富集到與癌癥和病毒感染有直接關系的通路上,包括癌癥通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的微小RNA等,另一部分負責調控信號通路,包括IL-17信號通路、TNF信號通路等。白細胞介素17(IL-17)是一種高度通用的促炎細胞因子,對各種過程至關重要,包括宿主防御,組織修復,炎癥性疾病發病機制和癌癥進展。TNF(腫瘤壞死因子)是一種促炎和抗炎細胞因子,可以TNF促進T細胞的活化和增殖,調節免疫應答,發揮抗炎的作用。根據上述合理推測中藥治療乳難疾病與IL-17、TNF等信號通路相關,但具體機制尚不十分明確,有待進一步研究。

綜上所述,基于網絡藥理學對“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡分析,系統地觀察藥物對疾病的影響,對中藥材治療乳汁分泌不足的作用機制進行整理和分析了解其化學成分與相關靶點的相互作用,通過富集分析進一步深入探討其作用機制。本研究為后續開發中藥澤瀉等獸藥治療動物乳難疾病提供研究基礎。