不同佐劑制備的豬偽狂犬基因缺失標記滅活疫苗免疫效果的比較研究

李曉艷,李 超,王 巖,喬煜婷,劉 超,齊志濤,楊 波,金 鷹,李化生,陳 堅,趙麗霞

(金宇保靈生物藥品有限公司,呼和浩特 010100)

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多種家畜和野生動物的急性傳染病。PRV屬于A型皰疹病毒亞科豬皰疹病毒Ⅰ型,可感染除人和無尾猿以外的哺乳動物,豬是該病的主要宿主和傳染來源。PRV呈爆發(fā)性流行,引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎,公豬不育,新生仔豬的大量死亡,育肥豬呼吸困難、增長停滯等臨床癥狀,是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一[1]。自2011年起,我國出現(xiàn)毒力增強的偽狂犬變異毒株,給中國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失[2-3]。國內(nèi)多家單位對變異PRV的單基因或多基因缺失疫苗進行大量的研究,這些基因缺失苗均可有效保護變異PRV對豬群的侵襲,但仍無法提供完全的保護,或存在安全性不足的問題。因此開發(fā)和制備安全性及免疫效果更好的豬偽狂犬基因缺失滅活疫苗,對于預防豬偽狂犬病和有效控制偽狂犬疫情具有重要意義。

毒株的選擇是預防疾病的關鍵,優(yōu)質的佐劑是疫苗質量穩(wěn)定的保障,為提升疫苗免疫效果,本試驗利用成功構建的PRV變異弱毒株(JS2012ΔgE株)開展了豬偽狂犬病滅活疫苗的研制工作,并對不同劑型佐劑進行了篩選研究。

1 材 料

1.1 主要試驗材料 PRV(JS-2012△gE株)滅活抗原液,批號2022005,病毒含量108.0TCID50/mL;用于做細胞中和試驗的PRV病毒液(JS-2012△gE株),F7,批號210709,病毒含量107.5TCID50/mL;BHK21 細胞(倉鼠腎細胞)、PRV標準陽性血清和陰性血清,均由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國家工程實驗室制備保存;水包油包水佐劑(ISA206)、水包油佐劑(ISA28VG)、水佐劑(Gel02)和油包水佐劑(ISA70VG),購自法國SEPPIC公司;PRV gB ELISA抗體檢測試劑盒,購自IDEXX公司。

1.2 主要試驗動物 30 日齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價不高于1∶4 或血清gB ELISA抗體檢測陰性,且PRV抗原檢測陰性)25頭,購自呼和浩特市土默特左旗國營種豬場;3～5 周齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價不高于1∶4 或血清gB抗體ELISA檢測陰性,且PRV抗原檢測陰性)共計55頭,購自呼和浩特市土默特左旗國營種豬場。

2 方 法

2.1 疫苗配制 取PRV純化濃縮滅活抗原液632 mL,平均分為4份,按照表1 中組分含量分別稱取ISA206 佐劑、ISA28VG佐劑、Gel02佐劑、ISA70VG佐劑,在28 ℃環(huán)境下將4 份水相分別緩慢加入4 份佐劑中,ISA206、ISA28VG、Gel02三組以400 r/min勻速攪拌10 min,ISA70VG組以10000 r/min勻速剪切15 min,以上各組疫苗2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 疫苗組別Tab 1 Vaccine groups

2.2 仔豬安全性檢驗 用30 日齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價不高于1∶4或血清gB ELISA抗體檢測陰性,且PRV抗原檢測陰性)25頭,隨機分為5組,每組5頭,1～4組分別耳后肌肉免疫ISA206、ISA28VG、Gel02、ISA70VG疫苗,單側耳根后肌肉單點注射疫苗6 mL,5組為對照組不免疫,逐日觀察10 d并監(jiān)測體溫,觀察免疫豬是否出現(xiàn)偽狂犬癥狀或明顯的局部和全身不良反應或因注射疫苗引起的死亡。

2.3 中和抗體監(jiān)測 用3～5 周齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價不高于1∶4或血清gB ELISA抗體檢測陰性,且PRV抗原檢測陰性)25頭,隨機分為5組,每組5頭,1～4組分別耳后肌肉免疫ISA206、ISA28VG、Gel02、ISA70VG疫苗,2 mL頭,5組為陰性對照組不免疫,一免后21 d以同樣劑量、同樣接種方法加強免疫一次,陰性對照組不免疫。分別于免前、一免21 d、二免28 d、二免60 d、二免90 d、二免120 d采血,進行細胞中和抗體監(jiān)測。

2.4 仔豬攻毒保護試驗 用3～5 周齡健康易感仔豬(PRV血清中和抗體效價不高于1∶4或血清gB ELISA抗體檢測陰性,且PRV抗原檢測陰性)30頭,隨機分為6組,每組5頭,1～4組分別耳后肌肉免疫ISA206、ISA28VG、Gel02、ISA70VG疫苗,2 mL/頭,5組為感染對照組不免疫,6組為陰性對照組不免疫不攻毒,一免后21 d以同樣劑量、同樣接種方法加強免疫一次,感染對照組及陰性對照組不免疫。二免后7 d連同感染對照組進行攻毒,每頭豬滴鼻JS2012株檢驗毒2 mL(病毒含量為106.00TCID50/mL),攻毒后連續(xù)觀察14 d,每日監(jiān)測體溫,并采集免疫組和對照組的鼻拭子和肛拭子監(jiān)測排毒情況。

2.5 臨床及組織病理變化觀察 攻毒后觀察試驗豬食欲、精神狀態(tài),是否出現(xiàn)由豬偽狂犬病病毒引起咳嗽、喘氣、張嘴呼吸、腹式呼吸等呼吸道癥狀以及共濟失調、麻痹、四肢亂劃、角弓反張等神經(jīng)癥狀,同時對攻毒試驗中發(fā)病死亡或試驗結束迫殺的仔豬,進行病理剖檢。取腦、肺臟、脾臟、肝臟等組織進行眼觀病變觀察并拍照。

3 結果與分析

3.1 理化檢驗結果 4組偽狂犬滅活疫苗理化檢驗均符合質量標準:ISA206組疫苗滴入水中,呈云霧狀擴散現(xiàn)象,為水包油包水型;ISA28VG組疫苗滴入水中,呈快速擴散現(xiàn)象,為水包油型;Gel02組疫苗滴入水中,完全溶解于水中;ISA70VG組疫苗滴入水中,呈油滴狀不擴散,為油包水型;穩(wěn)定性檢測均未出現(xiàn)分層;黏度分別為29.8 cP、13.6 cP、3.2 cP、42.7 cP,全部符合標準,詳見表2。

表2 4組偽狂犬滅活疫苗理化檢驗結果Tab 2 The physical and chemical test results of 4 groups of PRV inactivated vaccines

3.2 仔豬安全性檢驗結果 本實驗采用3 倍免疫劑量(6 mL/頭)對易感仔豬進行安全性檢驗,將制備的4組滅活疫苗肌肉注射仔豬,連同對照組觀察10 d并監(jiān)測體溫。結果顯示,ISA70VG組免后6 h至免后第2 d體溫升高至41 ℃,免后第3 d體溫恢復至正常,ISA206組免后6 h至免后第1 d體溫升高至40.5 ℃,ISA28VG組和Gel02組免后體溫正常,4組疫苗均未見疫苗引起的全身或局部不良反應,注射部位均未見紅、腫、熱等反應,仔豬發(fā)育良好,精神和食欲均正常。由此可見,ISA70VG因其油包水的劑型,刺激性稍大,引起短暫的體溫升高,而ISA28VG和Gel02佐劑無免疫副反應,不引起體溫升高,ISA206佐劑僅引起較小的體溫變化,隔日恢復正常,不影響采食活動。體溫監(jiān)測見圖1。

圖1 體溫監(jiān)測結果Fig 1 Temperature monitoring results

3.3 仔豬中和抗體監(jiān)測結果 將4 種疫苗免疫仔豬后,于一免21 d、二免28 d、二免60 d、二免90 d、二免120 d、二免150 d對試驗動物采血并分離血清,用細胞中和試驗測定中和抗體。陰性對照組中和抗體滴度<1∶21,免疫組抗體消長規(guī)律相似,一免21 d各免疫組抗體滴度無顯著性差異,均≤1∶26.5,二免后呈現(xiàn)快速上升的趨勢,二免28 d至二免60 d達到最高值,二免90 d各免疫組抗體開始緩慢下降,ISA70VG組二免后各時間段中和抗體滴度顯著高于其它免疫組(P<0.05,P<0.001),其最高值可達1∶210,其次是ISA206、ISA28VG、Gel02組,抗體值分別為1∶29、1∶29、1∶28,ISA70VG組抗體下降速度最慢,二免150 d,ISA70VG組抗體維持在1∶26～1∶27.5,ISA206組抗體維持在1∶24.5～1∶26,ISA28VG組及Gel02組抗體下降至1∶24.5和1∶23.5。試驗結果提示:油包水型(ISA70VG)疫苗在體內(nèi)的緩釋作用使抗體產(chǎn)生更高且持續(xù)期更長;水包油型(ISA28VG)疫苗及水佐劑型(Gel02)疫苗釋放抗原快,抗體值較低且持續(xù)期短;水包油包水型(ISA206)疫苗緩釋作用鑒于ISA70VG與ISA28VG之間。4 種疫苗免疫架子豬中和抗體檢測結果見圖2。

圖2 中和抗體結果Fig 2 Neutralization antibody results

3.4 仔豬攻毒保護結果 4組疫苗連同感染對照組于二免第7 d攻毒。攻毒結果:感染對照組攻毒后第2 d,5/5頭出現(xiàn)持續(xù)性體溫升高,并伴有典型的豬偽狂犬臨床癥狀,表現(xiàn)為精神沉郁、厭食、拉稀、呼吸困難,共濟失調并伴隨神經(jīng)癥狀,同時在攻毒后第6 d與第11 d出現(xiàn)死亡病例,死亡率為40%,免疫組除Gel02和ISA28VG各3/5頭出現(xiàn)持續(xù)性體溫升高的癥狀外,均未出現(xiàn)因豬偽狂犬病引起的臨床癥狀,4個免疫組均100%保護,存活率100%。攻毒后體溫與存活率見圖3、圖4。

圖3 攻毒后體溫監(jiān)測結果Fig 3 Temperature monitoring results after challenge

圖4 攻毒后各組豬存活情況Fig 4 Survival of piglets post challenged

3.5 仔豬攻毒后排毒結果 攻毒后第1 d至第14 d,檢測各免疫組及對照組鼻拭子和肛拭子排毒結果,感染對照組5/5頭持續(xù)排毒,排毒量最高,平均達106copies/mL,顯著高于免疫組(P<0.001),并于攻毒后第4～7 d,達到峰值;各免疫組較對照組排毒時間短,排毒量少;其中排毒時間最長且排毒量較高的組別是Gel02組,累計排毒10 d,平均排毒量為104.1copies/mL,ISA28VG組次之,累計排毒9 d,平均排毒量為103.1copies/mL,ISA206組累計排毒7 d,平均排毒量為102.2copies/mL,ISA70VG組累計排毒4 d,平均排毒量達102.0copies/mL;攻毒后14 d內(nèi),感染對照組仔豬的排毒量及排毒時間比其他各免疫組仔豬的排毒量高且時間長,ISA206組和ISA70VG組仔豬的排毒量相似且最低,ISA28VG組及Gel02組仔豬的排毒時間及排毒量均高于前兩組。進一步證明ISA70VG 佐劑和ISA206佐劑能更好地抑制試驗豬的排毒,降低PRV病毒感染風險。具體見圖5和圖6。

圖5 QPCR檢測鼻拭子排毒情況Fig 5 QPCR detection of nasal swab detoxification result

圖6 QPCR檢測肛拭子排毒情況Fig 6 QPCR detection of anal swab detoxification result

3.6 臨床及組織病理變化觀察 對攻毒試驗中發(fā)病死亡或試驗結束迫殺的仔豬,進行病理剖檢。取腦、肺臟、脾臟、肝臟等組織進行眼觀病變觀察并拍照。感染對照組病死或最終存活的仔豬大都體型消瘦且被毛粗亂,剖檢見腦脊液明顯增多,腦充血嚴重;肺部氣腫,并伴有出血、壞死、肉實變等;脾臟可見針狀出血點,壞死嚴重;肝臟邊緣淤血壞死等癥狀。ISA206組和ISA70VG組剖檢以上組織,均未見明顯眼觀病理變化;ISA28VG組和Gel02組2頭實驗豬解剖后肺部出現(xiàn)輕微的實變和出血點,脾臟有輕微出血點,腦組織輕微充血,其他組織均未見明顯眼觀病理變化。從病理變化結果進一步證明ISA70VG 佐劑組和ISA206佐劑組攻毒后無病理變化,優(yōu)于其他兩組。具本見圖7。

圖7 攻毒豬剖解的眼觀病變Fig 7 The autopsy lesions of piglets against poison

4 討 論

目前,國內(nèi)使用的豬偽狂犬疫苗主要有滅活苗、弱毒苗和基因缺失苗,這些疫苗對偽狂犬病的防控起到了一定作用。滅活苗在使用上較為安全,但也存在其抗原成分含量較低、接種劑量大和免疫效率低的缺陷,弱毒苗的免疫效果較好,價格低廉,但是存在毒株毒力返強風險,甚至弱毒苗會引發(fā)豬群潛伏感染[4],基因缺失疫苗不僅安全有效而且能夠區(qū)分免疫接種豬和野毒感染豬,為該病的控制與凈化提供了有效的手段。為了更好地提高豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性,增強滅活疫苗對豬只的免疫效果[5-6],本文篩選出4 種有代表性的佐劑,制備豬偽狂犬基因缺失標記滅活疫苗(JS2012ΔgE株),從疫苗的穩(wěn)定性、黏度、安全性、效力、攻毒保護五個方面評價,篩選出ISA70VG及ISA206可作為制備豬偽狂犬基因缺失標記滅活疫苗(JS2012ΔgE株)最理想的佐劑。

本研究篩選和評價佐劑的標準是:黏度低,易于注射;免疫刺激小,無不良反應;免疫效果好,攻毒保護率100%,且免疫持續(xù)期長。按照該標準初步篩選到兩款佐劑,為進一步研究豬偽狂犬滅活疫苗奠定基礎。其中ISA70VG免疫效果最好,其次是ISA206佐劑,兩種佐劑均為礦物油佐劑,前者為油包水劑型,后者是水包油包水劑型,兩者共性是均能形成油包水乳液包裹抗原,保護抗原使其不被機體中的酶類物質快速分解,并且油包水乳劑在注射部位貯存時間長,不能在短時間內(nèi)全部吸收代謝,因此也能延長其包裹的抗原在機體內(nèi)的貯存時間,持續(xù)刺激機體,促使巨噬細胞、淋巴細胞等的聚集和增殖,提升免疫效果,兩者不同之處是ISA70VG全部形成油包水乳液,ISA206佐劑有一半形成水包油乳液,該乳液與油包水乳液相比,因外層是水相,對機體的刺激作用明顯減弱,因此,ISA206佐劑在免疫效果上略遜色于ISA70VG,其他理化及安全性結果兩者相似。ISA28VG及Gel02 因其為水包油和水佐劑,外層均為水相,與油相相比,對機體的刺激效果較弱,且水相成分快速被機體中的酶類物質分解而降低了免疫持續(xù)期效果。

綜合以上結果,篩選的4 種不同佐劑制備的豬偽狂犬滅活疫苗(JS2012ΔgE株)對斷奶仔豬均能提供有效的保護,但ISA 206和ISA70VG更適合作為研制豬偽狂犬滅活疫苗(JS2012ΔgE株)的佐劑。