青蒿素及其衍生物對燒傷后肝臟損傷的保護作用機制

李齊齊，江 銘，邱 玲，胡 偉，胡克甦

（1 南通大學醫學院，江蘇 226001；2 南通大學附屬醫院燒傷整形科）

根據世界衛生組織統計,全球每年燒傷患者約1 100 萬人,其中重度燒傷導致死亡約30 萬人[1]。大面積燒傷引起的休克、敗血癥、全身多器官功能衰竭等嚴重并發癥是造成燒傷患者死亡的主要原因。嚴重燒傷時,一方面肝臟產生內質網應激,導致肝細胞凋亡,另一方面由于燒傷創面感染發生膿毒血癥,從而引發多臟器功能衰竭。肝臟一旦遭受實質性損害,不僅影響物質代謝、解毒、蛋白質合成等功能,而且影響抗生素效果。因此,保護肝臟是救治嚴重燒傷患者的重要環節。鐵死亡（Ferroptosis）是近年發現的一種細胞死亡方式,在炎癥中具有重要作用,幾種具有鐵死亡抑制作用的抗氧化劑表現出抗炎作用[2]。

青蒿素（Artemisinin,ART）是青蒿的主要有效成分,殺死瘧原蟲的主要機制涉及抑制Fe2+介導的自由基產生,增強對瘧原蟲DNA 損傷、線粒體去極化和細胞死亡作用,還涉及干擾肌漿/內質網鈣ATP 酶及線粒體電子傳遞鏈、影響免疫系統功能以及抑制血管生成[3]。此外,ART 在炎癥、免疫調節、血管生成和內質網應激中發揮作用,其抗炎及免疫調節作用已應用于肝臟疾病相關領域。

1 青蒿素通過AMPK/NF-κB/NLRP3 通路抑制炎癥反應

腺苷50-磷酸-活化蛋白激酶（adenosine-5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）是一種十分保守的調節劑,主要負責感知營養和控制能量平衡[4],參與調節炎癥反應[5]。B 細胞中核因子κ-B（nuclear factor κB,NF-κB）是Rel 家族重要的轉錄因子,廣泛分布于各種細胞中[6],參與細胞增殖、炎癥及獲得性免疫等多種重要生命活動。NF-κB 轉錄因子形成多種同源或異源二聚體:NF-κB1（p50）、NFκB2（p52）、RelA（p65）、RelB 和c-Rel。NF-κB1 在機體非激活狀態下與RelA 發生相互作用,而在機體激活狀態下,p50 在胞漿內處于靜息狀態[7]。在經典NF-κB1 信號通路刺激下,抑制性IκB α 蛋白被26S蛋白酶體磷酸化和降解,從而釋放活性轉錄因子異二聚體p50-RelA,進入細胞核調節靶基因的表達。NF-κB 在感染引起的炎性反應中被激活,在炎癥因子活化的情況下,AMPK 對NF-κB 具有明顯的抑制作用,并且NF-κB 信號通路與促炎細胞因子異常釋放密切相關[7]。通過轉錄一些細胞因子來介導免疫應答反應,清除入侵病原菌。嚴重燒傷后NF-κB 活化導致IL-6、TNF-α 和IL-1β 等炎性因子分泌。

在過度炎癥狀態下,多種免疫細胞受到病原菌相關分子（pathogen-associated molecular pattern,PAMPs）和損傷相關分子（damage associated molecular patterns,DAMPs）的活化,釋放大量促炎因子[8]。NLRP3 炎性小體作為固有免疫的重要組分,通過識別PAMPs 引發炎性反應。NLRP3 炎性小體可感知外源性和內源性各種危險信號,在靜息狀態下各類炎癥因子表達量水平極低,無法裝配或激活NLRP3 炎性小體。在被激活后NLRP3 炎性小體招募并激活procaspase 1,進而將IL-1β 的前體裂解激活[9]。研究顯示,NLRP3 水平隨著人類燒傷嚴重程度的增加而增加,NF-κB 信號通路活化對NLRP3 炎性小體的激活是必要的[9]。

有研究顯示,青蒿素干預可有效抑制NLRP3 炎性小體相關蛋白表達,促進AMPK 磷酸化,抑制NF-κB 和NLRP3 炎性小體的活化,從而導致下游炎癥細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）分泌減少[10]。青蒿素可以上調AMPK 表達,也可下調NF-κB p65 的活性,通過影響AMPK/NF-κB/NLRP3 炎性小體相關信號通路而發揮抗炎作用[11]。

2 青蒿素通過抑制內質網應激保護肝臟

內質網為膜狀網絡結構,發揮整合細胞信號和平衡內環境作用。內質網應激（endoplasmic reticulum stress,ERS）是指內質網中異常折疊蛋白聚集,引起細胞內Ca2+穩態失衡、去折疊蛋白反應、內質網過載等一系列反應。內質網應激激活細胞內應激通路,在脂質蓄積、胰島素抵抗、炎癥及隨后肝細胞死亡中發揮重要的病理生理作用。肝臟蛋白合成和糖脂平衡的維持中具有重要作用,特別容易受內質網應激的影響[12]。長期內質網應激超出細胞的代償能力,導致細胞凋亡。

YU 等[13]研究表明,青蒿素可抑制IL-6 釋放,雙氫青蒿素可顯著抑制小鼠RAW264.7 巨噬細胞IL-6、TNF-α 和一氧化氮釋放,并具有良好的劑量依賴性。雙氫青蒿素通過下調一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表達,抑制巨噬細胞炎性因子及一氧化氮分泌而發揮作用[14]。此外,青蒿素可抑制缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）的激活。炎癥刺激發生在細胞感染過程的早期,與細胞氧化還原、MAPK 信號激活和內質網應激的變化有關[15]。炎癥激活與內質網應激密切相關。內質網穩態的失調會引起未折疊蛋白反應（unfolded protein response,UPR）,持續UPR 是肝臟炎癥發生和發展的重要原因。在感染早期NF-κB 的激活與MAPK 信號和UPR 誘導劑IRE-1α 的表達增加相關[16]。UPR、MAPKs 及NF-κB 蛋白相互作用,但具體機制有待進一步研究。青蒿素不僅在減輕炎癥方面具有優勢,還可能通過抑制內質網應激作用保護肝臟。

3 青蒿素通過調節鐵死亡相關信號通路減輕肝纖維化

鐵死亡是由鐵超載、脂質過氧化及細胞膜破壞等多種因素引起的細胞程序性壞死。鐵是機體必需元素,但鐵過載會導致細胞鐵死亡。理論上,通過干預鐵代謝任何環節（吸收、儲存、利用和流出）增加細胞內鐵濃度可以誘導細胞發生鐵死亡。研究發現越來越多生理和病理生理過程涉及細胞鐵死亡及免疫反應失調,藥物或環境應激（如缺血再灌注損傷、晝夜節律鐘紊亂）引起的組織損傷均可引發細胞鐵死亡[3]。失調的細胞死亡機制以及異常的宿主反應是多種病理過程的特征,包括癌癥和炎癥相關疾病。過量的鐵積累和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的抑制是觸發鐵死亡的兩個關鍵初始信號。晚期糖基化終末產物受體（advanced glycosylation end product specific receptor,AGER）是免疫球蛋白超家族成員,可通過與多種損傷相關分子模式（danger associated molecular patterns,DAMPs）（如HMGB1、S100 等）結合激活多種信號途徑,如蛋白激酶C、JAK 信號轉導因子、轉錄激活因子（STAT）途徑酪氨酸磷酸化、MAPK/NF-κB 等[17]。AGER 信號與急性或慢性炎性疾病有關,如膿毒癥、胰腺炎和糖尿病。AGER 中和抗體或小發夾RNA（shRNA）研究證明AGER 在介導嗜鐵細胞啟動的炎癥和免疫反應中的關鍵作用[3]。DAMPs 是一類類似于感染性細菌蛋白,通過與模式識別受體（pattern recognition receptor,PRRs）作用,活化下游轉錄因子如NF-κB、IRF 等,從而誘導多種免疫反應[3]。細胞凋亡與鐵死亡是免疫原性的,隨著受影響的細胞釋放DAMPs 和報警蛋白,機體將產生一系列免疫原性相互作用,最終會放大細胞死亡并促進一系列與炎癥相關的反應[3]。

最新研究報道細胞鐵死亡可能在肝纖維化中發揮重要作用。CARLSON 等[18]研究闡明鐵死亡調節因子GPX4 對肝細胞存活和正常肝功能的重要性。肝臟調節代謝的能力由轉錄調節網絡控制,關鍵調節因子包括孤兒核受體成員,其中最重要的是過氧化物酶體增殖物激活受體α（recombinant peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα）、法尼類X 受體（Farnesoid X receptor,FXR）和肝X 受體（liver X receptor,LXR）[19]。這些受體都參與脂質穩態的基因轉錄,從而調節肝臟和全身的能量代謝。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）通過FXR 激活依賴機制限制肝星狀細胞（hepatic stellate cells,HSC）接觸,從而減輕肝纖維化[20]。DU 等[21]闡明信號分子（Hedgehog,Hh）和轉錄共激活因子相關蛋白（tran scription coactivator related protein,YAP）抑制劑降低HSC 活性,并抑制組織器官尤其肝臟中的成肌纖維細胞活性。YANG 等[22]證實,血紅素加氧酶1（heme oxygenase,HO1）通過調節NF-κB 通路促進HSC 凋亡,保護肝臟免受纖維化。青蒿琥酯是一種可溶于水的青蒿素類化合物,具有抗炎、抗腫瘤和免疫調節等多種藥理活性,是潛在的鐵死亡誘導劑。OOKO 等[23]已證明,青蒿素類化合物能引起腫瘤細胞鐵死亡。LIN 等[24]研究表明,青蒿素類化合物可特異性誘導腫瘤細胞凋亡[3],阻斷Nrf2-ARE 信號通路可增強耐藥細胞對鐵死亡的易感性。青蒿琥酯通過調節鐵垂病信號通路來減輕肝纖維化。

青蒿琥酯與鐵死亡標志分子GPX4、前列腺素過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2）、纖維化標志物α-平滑肌肌動蛋白（alpha sarco meric actin,α-SMA）共定位,機體釋放大量Fe2+,脂質過氧化,致使機體抗氧化能力降低。去鐵胺（deferoxamine,DFO）可以逆轉青蒿琥酯對肝臟的抗纖維化作用[20]。青蒿琥酯誘導的活化肝星狀細胞核變性是其抗纖維化作用所必需的。青蒿琥酯可激活HSC 鐵轉運,此作用與激活鐵蛋白的吞噬有關。

綜上所述,大面積燒傷患者會反復出現急性和長期肝功能異常。大量研究顯示,青蒿素及其衍生物具有抑制炎癥反應、保護肝臟及減輕肝纖維化等作用,有望成為燒傷臨床可供選擇的藥物,有利于改善燒傷患者的長期預后。