高效液相色譜串聯質譜法測定通心絡膠囊中3種化合物的含量

李霄,黃海,劉慢*

(1.黃河科技學院 河南省小分子新藥研發國際聯合實驗室,河南 鄭州 450063;2.河南邁英諾醫藥科技有限公司,河南 鄭州 450007)

隨著國家對中醫藥的重視,中成藥也得到了飛速的發展,以其具有性質穩定,療效確切以及毒副作用小的優點,使其在臨床上的應用日益增多[1-2]。例如自2019年12月爆發的新冠肺炎以來,中成藥蓮花清瘟膠囊在抗肺炎中發揮了獨特的作用和優勢[3]。中成藥由多種中藥材加工而成,有效成分較多,藥效物質基礎不明確,原料藥材容易受品種,產地,加工方法等因素的影響,使中成藥在質量控制方面有一定地阻礙。該選題主要以通心絡膠囊為例,在其目前質量控制檢測方法的基礎上,用超高效液相色譜串聯質譜同時檢測多種化學成分作為其質量控制標準。

通心絡膠囊收載于《中國藥典》2020 年版一部,主要由蟬蛻、水蛭、赤芍、全蝎、土鱉蟲、檀香、乳香、冰片、酸棗仁、蜈蚣、降香與人參制成,具有益氣活血、疏絡止痛的作用,對于治療冠心病心絞痛疾病有著明顯的療效,且無不良反應,副作用小,是近些年廣泛應用于治療腦血管疾病的中成藥制劑[4-8]。通心絡膠囊現行質量標準是以高效液相色譜(HPLC)測定赤芍中芍藥苷的含量(每粒不得少于0.30 mg)作為質量控制標準,該檢測方法靈敏度低,分離度低,色譜干擾性比較大,且檢測時間較長[9-12]。目前超高效液相色譜串聯質(UPLC-MS/MS)對復雜多組分的樣品測定具有很大的技術優勢,已經成為中藥質量控制的重要發展方向[13-17]。因此,該實驗主要使用UPLC-MS/MS儀器,建立同時測通心絡膠囊中3種成分(芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1)的含量的實驗方法,作為該藥物的質量控制標準。該分析檢測方法樣品處理簡單,專一性比較強,靈敏度高,分析檢測時間短,在通心絡膠囊的質量控制方面具有一定的應用價值。芍藥苷、斯皮諾素和人參皂苷Rg1的結構式分別如下圖1所示。

圖1 芍藥苷(a)、斯皮諾素(b) 和 人參皂苷 Rg1(c)的化學結構式

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

Agilent1290/6420 超高液相色譜-串聯質譜聯用儀,色譜柱(Agilent Poroshell Plus C182.1 mm×50 mm,1.9 μm),移液槍(美國瑞寧),十萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器);KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實驗試劑

超純水(湖南科爾頓水務有限公司);乙腈(質譜純,賽默飛世爾科技有限公司);甲醇(質譜純,賽默飛世爾科技有限公司);甲酸(上海瀚思化工有限公司);標準品:人參皂苷Rg1 (批號:B21055)和芍藥苷(批號:B21148)和斯皮諾素(批號:B21200)均購于上海源葉生物科技有限公司,所購得標準品的純度>98%。不同批次的通心絡膠囊樣品購于鄭州各藥店,樣品批號分別為:A2003009,A2005045,B2012020。

1.3 實驗方法

1.3.1 分析條件

色譜條件:Agilent Eclipes Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)色譜柱,流動相A:0.05%(體積分數)的甲酸水溶液,B:0.05%(體積分數)的甲酸-乙腈,流速:0.3 mL/min,進樣量:10 μL,柱溫箱:40 ℃,梯度洗脫程序:0～0.2 min,(90%A～10%B),0.2～5 min,(60%A～40%B),5～6 min,(0%A～100%B),6～8 min,(90%A～10%B)。

質譜條件:多反應監測模式(MRM),正/負離子掃描,(ESI)電噴霧離子源,脫溶劑氣體是N2,流速為12 L/ min,離子化溫度為345 ℃,毛細管電壓為4.0 kV,碰撞氣氮氣。三個分析物的質譜檢測見表1,提取的分析物的總離子流圖見圖2。

表1 3個分析物的UPLC-MS/MS檢測參數

圖2 標準品(a), 芍藥苷(b) ,斯皮諾素(c)和人參皂苷Rg1 (d)的多反應監測(MRM)色譜圖

1.4 溶液的配制

1.4.1 對照品溶液的配制

分別準確稱取芍藥苷、斯皮諾素和人參皂苷Rg1標準品5.0 mg于10 mL的容量瓶中,并使用50%(體積分數)甲醇溶解后定容,搖勻,即可得0.5 mg/mL的標準溶液。再分別使用移液槍移取600 μL的芍藥苷、40 μL斯皮諾素和40 μL的人參皂苷Rg1到10 mL的容量瓶中,用50%的甲醇定容后分別制成含芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1 標準品30.0 μg /mL,2.0 μg /mL,2.0 μg /mL的混合對照品溶液待用。

1.4.2 供試品溶液的配制

精密稱量通心絡膠囊粉末100.00 mg到10 mL容量瓶中,用50%的甲醇溶解并定容,隨后超聲10 min使其溶解均勻。取其超聲后溶液用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾,所得濾液即為供試品溶液。

2 實驗結果

2.1 實驗結果

2.1.1 線性關系考察以及檢出限和定量限

吸取0.5 mL混合對照品溶液,在“1.4.1”基礎上,再稀釋一倍,配成芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的質量濃度分別為10,1,1 μg/mL的混合對照品。并對其進行逐級稀釋,使形成濃度梯度。按照“1.3.1”的分析方法測試,記錄各濃度下芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的色譜峰面積,以化合物的濃度為橫坐標,定量離子的峰面積為縱坐標,得每個化合物的線性回歸方程和線性關系。芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的回歸方程、相關系數及線性范圍分別為:y=22 595x+57 989,r=0.998 1,10.0～10 000.0 ng/mL;y=56 364x+1 429.6,r=0.999 6,1.0～

1 000.0 ng/mL;y=3 591x+64.388,r=0.998 0,10.0～1 000.0 ng/mL。在10 ng/mL的混合對照品的基礎上,50%的甲醇水稀釋,按照“1.3.1”的分析方法測試,當信噪比S/N是3和10時得該方法的檢測限和定量限。其檢測限分別為:2.0,0.4,3.4 μg /mL;定量限分別為:6.8,1.4,11.5 μg /mL。

2.1.2 精密度試驗

取“1.4.1”項下制備的混合對照品溶液,按“1.3.1”項下所記錄分析條件連續進樣6次,并進行測定,結果顯示:芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1峰面積的RSD值分別是0.45%,0.64%,2.01%,表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復性試驗

精密稱取通心絡膠囊樣品6份,按“1.4.2”項下所記錄方法處理,平行制備6份供試品溶液,按“1.3.1”項下分析方法進樣,結果顯示芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1峰面積的RSD值分別為1.8%,2.3%,2.2%,表明該方法重復性良好。

2.1.4 穩定性試驗

按照“1.4.2”項下條件配置供試品溶液,按“1.3.1”項下所記錄分析條件,分別在0,2,4,6,8,24 h進行測定,結果表明芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷 Rg1峰面積的RSD值分別為:2.5%,4.2%,3.6%。說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.5 加標回收率試驗

取同一批次樣品(批號:A2003009),按“1.4.2”項下記所錄方法處理,平行制備6份供試品溶液,按“1.3.1”項下所記錄分析條件,測出其芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的峰面積,并依據“1.4.3”項下的線性回歸方程,計算出每組樣品中芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷 Rg1的濃度。再將這6份供試品溶液每份各取200 μL于樣品小瓶中,并各加“1.4.1”項方法下配制的混合對照品溶液200 μL,得到通心絡膠囊的樣品加標溶液。按“1.3.1”項下所記錄的分析條件進行處理,記錄峰面積并計算其加標回收率。計算結果見表2。

表2 芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷 Rg1 的加樣回收率結果(n=6)

2.2 樣品含量測定

本次測量選取同一廠家3個不同批次的樣品,每個批次按“1.4.2”項下所記錄的方法制配6份樣品,按“1.3.1”項下所記錄分析條件進行分析,記錄峰面積并計算樣品中芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的含量的平均值。結果見表3。

表3 通心絡膠囊中芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1含量(n=3) 單位:μg/g

3 討論

3.1 檢測方法選擇

本實驗初期使用HPLC法檢測,由于人參皂苷Rg1含量低,紫外吸收弱,斯皮諾素與芍藥苷的極性相近,分離度和靈敏度均比較低,且樣品背景干擾比較大,實驗結果的準確性相對較差,故選擇專一性相對較強,靈敏度相對較高的LC-MS/MS的MRM(多反應監測)模式進行定量檢測。

3.2 色譜條件選擇

并對該檢測方法的色譜條件的優化:考察了不同體系的流動相和不同的色譜柱對樣品分離效果的影響。分別采用中性乙腈和水體系、乙腈(0.02% 甲酸,體積分數)和水乙腈(0.02%甲酸,體積分數)體系,實驗發現在酸性體系下,化合物的峰型對比較對稱以及質譜信號較強。由于芍藥苷與斯皮諾素的極性相近,故實驗過程中我們試驗了三根色譜柱,化合分別是:Agilent Poroshell 120 Ec-C18(3.0 mm×50 mm,2.7 μm)、Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell 120 Ec-C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)。結果表明:在使用Agilent Poroshell 120 Ec-C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)柱時芍藥苷與斯皮諾素的分離度最比較大。同時該方法采用梯度洗脫,可以有效提高洗脫能力,節省溶劑,縮短分析時間。

3.3 質譜條件優化

質譜條件進行優化,人參皂苷Rg1、芍藥苷都在負離子模式下質譜信號強,而斯皮諾素在正離子模式下質譜信號強。通過離子掃描找尋三個化合物相對應的碎片離子,并優化了MRM檢測模式下每個化合物的裂解電壓和碰撞能量,以保證被檢測的化合物都有較高的質譜響應信號。

3.4 樣品處理條件的優化

在處理樣品時,我們分別從溶劑的種類,比例、超聲的時長上進行優化。首先分別使用75%乙醇,50%、75%的甲醇水溶液和純甲醇溶解樣品(不同比例的溶劑都做三組平行實驗),檢測結果表明,使用50%甲醇水溶液作溶劑時相較于其他比例的溶劑3個化合物有最大峰面積。再以50%的甲醇水溶液處理樣品,分別設置超聲時間為10,20,30,40 min。結果表明:超聲10 min后3個化合物的峰面積已經達到最大值。

4 結論

使用UPLC-MS/MS建立了快速檢測通心絡膠囊中芍藥苷、斯皮諾素和人參皂苷Rg1含量的方法,并對該方法進行了方法學驗證,該方法具有前處理簡單、靈敏度高、檢測時間短、專一性強等優點,為通心絡膠囊的質量標準以及質量控制的完善提供了可靠依據。