氣相色譜法測(cè)定2,6-二甲基苯胺中的10種相關(guān)雜質(zhì)

郄一奇,韓靜,湯金春,鐘毓靈,張皓閱,蘇夢(mèng)翔,3,4*

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析系,江蘇 南京 210009;2.常州康普藥業(yè)有限公司,江蘇 常州 225600;3.藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)藥科大學(xué)),江蘇 南京 210009;4.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑及輔料研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210009)

2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline,2,6-DMA)是苯環(huán)上2-,6-位置的氫原子被甲基取代后形成的芳香伯胺,是制備利多卡因、吡咯卡因、布比卡因等酰苯胺類局部麻醉藥的關(guān)鍵起始物料之一[1],也常被用于農(nóng)藥、染料、抗氧化劑、香料、合成樹脂等的制造[2]。此外,該化合物是利多卡因、賽拉嗪等藥物的關(guān)鍵代謝物[3-4],也是一種可能的人類致癌物(2B類致癌物)[5]。

2,6-DMA可由原料間二甲苯經(jīng)硝化還原制得[6]。基于其生產(chǎn)工藝,原料間二甲苯、中間體2,4-二甲基硝基苯和2,6-二甲基硝基苯、副產(chǎn)物2,4-二甲基苯胺均屬于關(guān)鍵雜質(zhì)需進(jìn)行質(zhì)量控制。此外,間二甲苯由混合二甲苯分離制得[7]。間二甲苯中可能含有的鄰二甲苯、對(duì)二甲苯、甲苯等雜質(zhì),也會(huì)在后續(xù)反應(yīng)中生成其他二甲基苯胺異構(gòu)體雜質(zhì)和甲苯胺異構(gòu)體雜質(zhì)。這些異構(gòu)體雜質(zhì)結(jié)構(gòu)相似,可能具有相似或者更為嚴(yán)重的毒性[8]。因此,嚴(yán)格控制2,6-DMA中的有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體雜質(zhì),以盡量減少后續(xù)步驟中類似異構(gòu)體雜質(zhì)的形成,對(duì)于開(kāi)發(fā)更安全、更有效的藥物至關(guān)重要。2,6-DMA及其相關(guān)雜質(zhì)的化學(xué)信息如表1所示。

表1 2,6-DMA及其雜質(zhì)的化學(xué)信息表

目前,已報(bào)道的分析方法主要集中于2,6-DMA異構(gòu)體的分離,多采用衍生化或新型固定相氣相色譜法[9-13],操作繁瑣,容易產(chǎn)生副產(chǎn)物,適用性不高。Marrisetti等人開(kāi)發(fā)了超高效液相色譜法對(duì)6個(gè)2,6-DMA異構(gòu)體和2個(gè)降解雜質(zhì)鄰甲苯胺、對(duì)甲苯胺進(jìn)行定量分析[14],但該方法依賴于高性能儀器,且未涵蓋原料間二甲苯和中間體2,4-二甲基硝基苯、2,6-二甲基硝基苯等關(guān)鍵雜質(zhì)。

本研究使用市售毛細(xì)管色譜柱對(duì)2,6-DMA中的10種雜質(zhì)(原料、中間體、副產(chǎn)物、異構(gòu)體雜質(zhì)、降解雜質(zhì))進(jìn)行直接分離,采用氣相色譜外標(biāo)法進(jìn)行定量分析,較已有方法操作更加簡(jiǎn)單、涵蓋雜質(zhì)種類更多、適用性更強(qiáng)。方法已成功運(yùn)用于鹽酸利多卡因起始物料2,6-DMA的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Trace 1310氣相色譜儀,含氫火焰離子化檢測(cè)器、AI 1310自動(dòng)進(jìn)樣器和Chromeleon 7.2 SR5數(shù)據(jù)工作站,美國(guó)Thermo公司;MSE125P十萬(wàn)分之一電子天平,瑞士Sartorius公司。

1.2 藥品與試劑

間二甲苯(純度99.2%,批號(hào)05-Jan-LX41-9-06)、2,4-二甲基硝基苯(純度98.6%,批號(hào)13-Nov-LT18-4-05)、2,3-二甲基苯胺(純度100%,批號(hào)30-Dec-LD98-7-03)、2,4-二甲基苯胺(純度99.1%,批號(hào)11-Jan-LD17-2-05)、2,5-二甲基苯胺(純度100%,批號(hào)27-Sep-LD98-5-03)、3,4-二甲基苯胺(純度98.7%,批號(hào)06-Mar-LD98-8-04)、3,5-二甲基苯胺(純度100%,批號(hào)24-Sep-LD98-6-03)、鄰甲苯胺(純度98.9%,批號(hào)04-Mar-LT83-2-02)、對(duì)甲苯胺(純度99.3%,批號(hào)06-Mar-LT83-4-02)均購(gòu)于美國(guó)Lovan Research Chemicals公司;2,6-二甲基硝基苯(純度99.8%,批號(hào)21100052)、2,6-二甲基苯胺(純度99.5%,批號(hào)21040820)均購(gòu)于中國(guó)壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;2,6-二甲基苯胺樣品(批號(hào)20210120、20210310、20210625)均購(gòu)于常州市如立化工有限公司;甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱DB-FFAP型毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);程序升溫,起始溫度為60 ℃,維持10 min,以15 ℃/min的速率升溫至110 ℃,維持56 min,再以25 ℃/min的速率升溫至200 ℃,維持10 min;進(jìn)樣口溫度230 ℃;氫火焰離子化檢測(cè)器溫度235 ℃;載氣氮?dú)?流速1.0 mL/min;分流比10∶1;進(jìn)樣量1 μL。

2.2 溶液配制

對(duì)照品儲(chǔ)備液:取各雜質(zhì)對(duì)照品50 mg,精密稱定,分別置5 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含10 mg的各雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液。

對(duì)照品混合儲(chǔ)備液:分別精密量取各雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液500 μL,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含500 μg的雜質(zhì)對(duì)照品混合儲(chǔ)備液。

對(duì)照品溶液:精密量取對(duì)照品混合儲(chǔ)備液1 mL,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含50 μg的對(duì)照品溶液。

供試品溶液:取供試品500 mg,精密稱定,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含50 mg的供試品溶液。

系統(tǒng)適用性溶液:取供試品500 mg,精密稱定,置10 mL棕色量瓶中,加適量甲醇溶解,加入雜質(zhì)對(duì)照品混合儲(chǔ)備液1 mL,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

取空白溶劑(甲醇)、各雜質(zhì)對(duì)照品定位溶液和系統(tǒng)適用性溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果如圖1所示,相鄰色譜峰分離良好,2,4-二甲基硝基苯&2,5-DMA,2,3-DMA&3,5-DMA,3,4-DMA&未知雜質(zhì)之間的分離度可達(dá)1.98,1.95和1.73。表明該方法專屬性好。

時(shí)間/mina.空白溶劑;b.間二甲苯;c.2,4-二甲基硝基苯;d.2,6-二甲基硝基苯;e.2,3-DMA;f.2,4-DMA;g.2,5-DMA;h.3,4-DMA;i.3,5-DMA;j.鄰甲苯胺;k.對(duì)甲苯胺;l.系統(tǒng)適用性溶液。圖1 專屬性試驗(yàn)的典型色譜圖

2.3.2 檢測(cè)限與定量限

取雜質(zhì)對(duì)照品混合儲(chǔ)備液,用甲醇逐級(jí)稀釋,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖,分別以信噪比(S/N)為3和10時(shí)的溶液濃度作為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果如表2所示,各雜質(zhì)的檢測(cè)限在2.39～14.94 μg/mL范圍內(nèi),間二甲苯、2,4-二甲基硝基苯、2,6-二甲基硝基苯、2,4-DMA,2,5-DMA,鄰甲苯胺、對(duì)甲苯胺的定量限為5 μg/mL;2,3-DMA和3,5-DMA的定量限為10 μg/mL;3,4-DMA的定量限為30 μg/mL。

表2 檢測(cè)限和定量限、線性的試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 線性與范圍

取雜質(zhì)對(duì)照品混合儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋成濃度在各雜質(zhì)定量限～200 μg/mL范圍內(nèi)的系列濃度溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果如表2所示,各雜質(zhì)的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.990,表明各雜質(zhì)在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 準(zhǔn)確度

取9份供試品各500 mg,精密稱定,分別置10 mL棕色量瓶中,加入雜質(zhì)對(duì)照品混合儲(chǔ)備液適量,分別配制成低、中、高三個(gè)不同雜質(zhì)濃度水平的溶液,一式三份。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果如表3所示,各雜質(zhì)的平均回收率(n=9)在88.17%～108.17%范圍內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均<10%,表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性的試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 精密度

按“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液配制方法制備1份進(jìn)樣精密度溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次并記錄色譜圖。結(jié)果如表3所示,各雜質(zhì)峰面積的RSD均<5%,表明該方法進(jìn)樣精密度良好。

由兩人分別在不同天按“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液配制方法平行配制6份溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果如表3所示,6份重復(fù)性溶液中各雜質(zhì)含量的RSD均<5%,12份中間精密度溶液中各雜質(zhì)含量的RSD均<5%,表明該方法重復(fù)性和中間精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性

按“2.2”項(xiàng)下配制1份對(duì)照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液,室溫放置。以4.4 h為間隔,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果如表3所示,在44 h內(nèi),主成分和各雜質(zhì)峰面積的RSD均<10%,表明對(duì)照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液室溫放置44 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 耐用性

按“2.2”項(xiàng)下配制1份對(duì)照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液,分別在不同初始柱溫(60±5)℃、不同流速(1.0±0.1)mL/min、不同進(jìn)樣口溫度(230±5)℃、不同檢測(cè)器溫度(235±5)℃條件下進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果顯示,不同條件下,系統(tǒng)適用性溶液中各雜質(zhì)與相鄰峰之間的分離度均>1.5,各雜質(zhì)含量的RSD均<10%,表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品測(cè)定

取3批次的2,6-DMA樣品,按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法配制供試品溶液,一式兩份。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

在溶劑方面,考察了常見(jiàn)溶劑二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺和甲醇作為潛在溶劑。結(jié)果顯示二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺溶劑中含有較多雜質(zhì)峰。由于待測(cè)物種類較多,且異構(gòu)體之間分離難度較大,為了避免溶劑雜質(zhì)對(duì)待測(cè)物出峰產(chǎn)生更多的干擾,最終選擇使用甲醇作為溶劑。

3.2 色譜柱的選擇

在色譜柱的選擇中,測(cè)試了不同極性固定相的毛細(xì)管柱,如Agilent J&W HP-1(30 m × 0.53 mm × 3 μm)、HP-5(30 m × 0.53 mm × 5 μm)、DB-624(30 m × 0.53 mm × 3 μm)、DB-FFAP(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)。結(jié)果顯示,在強(qiáng)極性色譜柱上,各異構(gòu)體雜質(zhì)之間均能得到良好分離,故選擇了DB-FFAP型毛細(xì)管柱作為試驗(yàn)用色譜柱。

3.3 柱溫、流速的優(yōu)化

由于待測(cè)物種類較多,沸點(diǎn)差異較大,考慮采用程序升溫色譜法。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2,4-二甲基硝基苯&2,5-DMA、2,3-DMA&3,5-DMA、3,4-DMA&未知雜質(zhì)是較難分離的關(guān)鍵雜質(zhì)對(duì)。在其他雜質(zhì)得到良好分離的情況下,試驗(yàn)進(jìn)一步探討了不同初始溫度和升溫速率對(duì)三對(duì)關(guān)鍵雜質(zhì)分離效果的影響。隨著上述因素的合理變化,分離效果不顯著。最終,通過(guò)優(yōu)化柱流速和第二平臺(tái)期柱溫,在柱溫110 ℃、流速1.0 mL/min時(shí),各組分之間實(shí)現(xiàn)了良好分離。

4 小結(jié)

本研究建立了氣相色譜法對(duì)2,6-DMA樣品中可能存在的10種雜質(zhì)進(jìn)行了定量分析,并完成了完整的方法學(xué)驗(yàn)證及測(cè)樣。方法學(xué)結(jié)果表明提出的方法專屬性良好、精密度、準(zhǔn)確度高。此方法的優(yōu)勢(shì)是對(duì)包括合成原料、中間體、異構(gòu)體雜質(zhì)等在內(nèi)的10種雜質(zhì)進(jìn)行了分離和定量測(cè)定,且無(wú)需衍生化等前處理手段。方法簡(jiǎn)便、可靠,可用于經(jīng)間二甲苯硝化還原制得的2,6-DMA的質(zhì)量控制。