河豚毒素研究綜述

王世光,曾軍杰

(浙江省海洋水產研究所,浙江海洋大學海洋與漁業研究所,浙江 舟山 316021)

1 研究背景

1.1 河豚魚資源概況

河豚一般指硬骨魚綱的魚類,經常在長江口岸活動,江浙百姓都習慣稱呼它為 “河豚魚”。目前,已經發現的河豚魚種類就已高達數百種之多,常見的河豚魚也有幾十種,而無毒的種類較少,僅為20種左右。在我國發現的河豚魚有40多種,分8個屬,從45°N到45°S都有分布,我國主要分布于長江下游一帶和沿海地區[1-2],主要品種及毒力分布見表1。當河豚魚發現異常狀況時,通常體內會產生TTX來躲避敵人帶來的威脅。河豚魚的美味由來已久,然而食用者發生死亡的例子也時有發生[3],所以在中國,從1998年開始就已經禁止食用,甚至在東南亞的一些國家都頒布法令,禁止河豚魚在市場上流通,我國民間也因此有了“拼死吃河豚”的說法。2016年以來,農業農村部逐漸開放河豚魚養殖,遼寧、江蘇、廣東等共16家企業為養殖試驗點,品種為紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀。

表1 我國常見河豚魚品種、分布海域及各器官毒力情況

1.2 河豚毒素介紹

河豚毒素(Tetrodotoxin,簡稱TTX)是生物體內所含比較常見的生物堿。它是毒性極強的神經毒素,毒力約為氰化物的1 250倍。對于TTX的來源眾說紛紜,既有認為TTX是外源性的,也有認為是內源性的,至今都沒有一個準確定論[4-5]。

TTX相對分子質量為319.27[6],分子式C11H17N3O8。主要存在于卵巢、肝臟等部位中[7],含毒量以卵巢和肝臟最高,且性質穩定,普通烹飪手段較難破壞。常見的同系物[8]較多,主要為5-deoxyTTX、11-deoxy、4,9-anhydro TTX、5,11-dideoxy TTX、6,11-dideoxy TTX、5,6,11-trideoxy TTX、4,9-anhydro-5,6,11-trideoxy,見圖1。TTX純品為白色結晶體,在弱酸性溶液中溶解性極好,弱堿環境下會發生自然沉淀。TTX能以兩性離子存在,在強酸強堿中均會遭到破壞,強堿可使其破壞為無毒化合物:2-氨基-8羥基-6羥甲基-喹唑啉。

圖1 河豚毒素及其同系物的分子結構式(圖片源于網絡)

TTX 的分子量較小,結構特殊,易溶于弱酸性溶劑,在強酸和強堿的溶劑中結構易遭到破壞,在20世紀60年代初,國外學者[9-12]對TTX構造進行了深入的研究,經歷了15年之久的研究,采用制備衍生物及進行X衍射實驗方法等,終于發現TTX 籠形原酸酯類結構,結構中的碳原子全部為不對稱取代,在游離狀態下以3種形態相互平衡的混合物存在[13]。

1.3 河豚毒素應用進展

目前,我國渤海、黃海、東海海域一直延伸至南海海域,一共生活著形形色色的河豚魚,共計40多種,一年捕撈量可達數萬噸,效益高達幾十億。人們在追求無毒河豚魚的同時,卻遺忘了市場需求量更大的TTX,自從2016年河豚魚養殖開禁,TTX一直呈現出一種供不應求的狀態。據調查,每克TTX粗品市場價達8萬元,純度97%以上的TTX純品價格為30萬元。

TTX作為局麻藥,其麻醉作用比一般的麻醉藥效果強16萬倍,TTX通過對動作電位的阻斷來影響人們的生理活動甚至破壞神經[14-15]。研究發現[16]癌癥病人的疼痛可以通過TTX的注射來進行緩解,效果甚至比臨床常用的杜冷丁還好。TTX的作用不僅僅能減輕劇痛,對呼吸系統疾病的緩解,對甲腎上腺素的抑制,對心腦血管系統疾病的緩解都具有特別突出的療效等[17-18]。在用于緩解癌癥晚期的劇烈疼痛和戒毒時,患者不會上癮,是化學藥物和中草藥的優良替代品。

2 研究現狀

2.1 河豚毒素檢測方法

2.1.1 小鼠生物檢測法

20世紀40年代,Kao[19]開始進行小鼠生物檢測法,當一定濃度的TTX被注射進入小鼠體內后,小鼠會呈現出死亡狀態,并且死亡時間和TTX含量有一定的線性關系。起先表示TTX毒力的是鼠單位(MU)[20],在實驗條件下,一只20 g的小鼠皮下注射0.2 mL TTX 溶液,10 min死亡的劑量為1個鼠單位。這種方法操作簡單,不需特殊設備,但需要大量老鼠,且容易受小鼠個體差異影響,重復性較差。

2.1.2 酶聯免疫檢測法

20世紀80年代,酶聯免疫法[21]測定TTX逐漸廣泛應用,它是根據抗原與抗體的結合,以及氫鍵等鍵能影響衍生出來的一種分析方法。Matsumura[22]采用酶聯免疫的方法對TTX進行了定性分析,由于酶聯免疫法的靈敏度較高,能夠確保這種特異性及定量關系,在篩選水產品中TTX的情況下,一次性可進行大批量實驗,但酶聯免疫存在著一定情況的假陽性。

2.1.3 理化檢測法

2.1.3.1 熒光、紫外分光光度法

熒光法的檢測原理是TTX在堿性環境下發生水解產生C9,TTX的含量是通過C9堿來定量的。這是最早建立起來的定量檢測TTX的方法,曹愛英等[23]利用NaOH與TTX進行柱前衍生,TTX衍生物在最大激發波長為370 nm,最大發射波長為495 nm條件下具有熒光性。TTX在衍生產生C9的同時,副產物也伴隨有同等質量的草酸鈉產生,它在230 nm的波長下有明顯的紫外光吸收,因此用紫外分光光度法也能對TTX定量檢測。熒光、紫外分光光度法均能檢測TTX,但靈敏度以及準確度與其他檢測的方法相比還是有所欠缺。

2.1.3.2 薄層色譜法

薄層色譜法[24]是一種比較傳統的鑒定手段,具有簡單易行,易操作,分離效果好等特點,應用范圍比較廣泛。該法根據TTX極性比較大這一特性,將它與氫氧化鈉進行反應,產生顯色物質從而定性測量。點板常用的展開劑為正丁醇、乙酸、水體積比4∶1∶2,最低檢出限為4.0×10-9mg/L,但是這種方法只能用于TTX的定性分析,應用并不廣泛。

2.1.3.3 高效液相色譜(HPLC)法

HPLC-熒光檢測器(FLD)、紫外檢測器(UV)法是實驗室中使用最為普遍的檢測方法,主要通過不同的檢測器對檢測物質進行定量。在堿性條件下,將TTX進行衍生,產生的衍生物質具有可見光吸收信號,可以通過熒光檢測器或紫外檢測器進行檢測。熒光衍生的反應機理:TTX分子上有1個pKa值很高、在水溶液中極易質子化、在堿性溶液中非常不穩定的胍基和1個在酸或堿中均易發生水解的原羧酸基。辛少平等[25]對TTX衍生化,優化了色譜條件,建立了新的檢測方法,該方法檢測限低,靈敏度高,重復性好。

蒸發光散射檢測器(ELSD)是通用型檢測器,TTX在經HPLC-ELSD檢測時有明顯的響應,主要由于TTX只有在紫外波長200 nm下才有較弱吸收峰,但在ELSD下有明顯的折射光。王小逸等[26]聯合使用HPLC-ELSD,對TTX進行純化研究,以YWG-C18為色譜柱,發現ELSD檢測靈敏度高、檢測限低,同時還具有良好的線性,基線非常平穩,在檢測分析方面有著良好的性能。

2.1.3.4 HPLC-MS/MS法

HPLC-MS/MS是近些年國內外研究熱點,主要通過對目標離子進行轟炸,產生多個離子碎片,對響應最高的子離子再次碎裂,最終得到定性、定量離子片段,以此對目標物質進行分析。免疫親和柱凈化-HPLC-MS/MS是目前使用頻率最高檢測TTX的方法。免疫親和柱是利用TTX與柱填料內小鼠腹水特異性識別的特點,TTX以小鼠腹水作為載體發生結合,隨后去除基質,達到凈化的效果。嚴忠雍[27]開發的免疫親和柱凈化-UPLC-MS/MS法,線性范圍廣、靈敏度高,檢測限低至0.3 ng/mL,遠遠低于其他檢測TTX的方法,此方法應用非常廣泛。

2.1.3.5 GC-MS/MS法

隨著質譜技術的發展,GC-MS/MS憑借超強的定性能力,已經成為最有效、最準確的檢測分析方法之一。氣相色譜-質譜法主要利用TTX水解產生的衍生物,經凈化、衍生化后進行全掃描方式檢測,定量離子392。吳平谷等[28]對該法進行了優化,選擇的色譜柱為:HP-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱,不分流進樣,流速控制在110 mL/min。建立了比較完善的TTX前處理及氣相色譜-質譜法檢測體系,具有靈敏度高、重復性好等眾多優點。

近年來,眾多新興技術逐漸進入大眾的視線,仿生納米酶因其具有結構簡單、化學性質穩定的特點引起了廣泛關注,張金艷等[29],通過基于氧化石墨烯修飾的金屬網作為捕獲探針,以及 AuPtRh 三金屬納米酶連接核酸適配體作為信號探針,開發出了一種SSM-GO/AuPtRh-aptamer傳感器對河豚毒素進行捕獲。

2.2 河豚毒素提取、純化工藝現狀

2.2.1 河豚毒素的提取

TTX主要用酸性水溶液或酸性甲醇溶液提取,陳成添等[30]采用熱甲醇法、微火煮沸法、沸水浴法對河豚魚混合卵和混合肝進行毒素提取,發現水浴提取效果較佳。黃枝梅等[31]則通過超聲輔助提取替代了水浴提取TTX,大大地提高了對TTX提取的效率。

2.2.2 河豚毒素的分離技術

2.2.2.1 中性氧化鋁柱層析法

中性氧化鋁具有多孔疏松結構,能夠進行物理吸附。較早就有報道,日本學者[32]用一系列方法提取粗品TTX溶液,而后,用氧化鋁柱純化制備,得到LD50為13 μg/kg的TTX,這也是最早的提純TTX的方法。

2.2.2.2 活性炭柱層析法

活性炭是種吸附性能極強的非極性物質,無固定形狀,因其孔徑繁多而使表面積增大,這一特性使得在吸附物質時效果更好于其他吸附劑。當對TTX提取液進行吸附純化時,大部分色素及組織能被活性炭保留,極性較大的TTX反而能夠被洗脫下來,但不足的是TTX的毒力也會有一定的損失。根據這一原理,王智等[33]利用C18進行萃取,作為前處理的凈化方法開發了UPLC-MS/MS法測定食品中的TTX,該方法回收率高、重復性好,精密度與準確度都能滿足日常監測需求。

2.2.2.3 離子交換柱層析法

離子交換樹脂柱層析法是現階段使用比較廣泛的一種提純手段。TTX在弱酸性溶液中以銨鹽C11H16O8N2NH2+存在,在溶液中與離子交換劑進行結合,因為各組分之間的親和力不同而使TTX達到分離的目的。該法主要選擇D152,D101等幾種型號的離子交換樹脂。黃枝梅等[34]對D152樹脂吸附TTX進行了詳細的報道,從吸附方式、樣液pH值、洗脫工藝等幾個方面深入探究了層析條件,該方法為TTX大規模化制備提供了堅實的理論基礎。

2.2.2.4 凝膠柱層析法

凝膠柱層析法主要機理是分子篩效應,當TTX提取液用來柱層析純化時,進入孔徑較小凝膠柱后,較大分子的蛋白質,色素類物質因為被阻擋不能進入凝膠孔隙中,而較小的分子的TTX則能進入凝膠孔隙,加入一定量的洗脫劑,蛋白質類分子就隨洗脫劑從凝膠間隙洗脫下來,受到的阻力越小,能夠越快地從柱床餾出,TTX分子物質則從上一層凝膠孔隙中出來又擴散到下一層凝膠孔隙中,這樣多次反復,大分子物質首先從層析柱床中餾出。Firoz Ahmed[35]采用Bio-gel公司的P2型號凝膠進行柱層析純化,使TTX純度提升至45%以上。

2.2.2.5 膜分離技術

膜分離技術主要根據分步截取不同分子量物質的原理進行純化。易瑞灶等[36]主要通過微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜等多級膜分離技術制備高純度TTX,通過此技術將TTX純度提升至99%以上,并能進行規模化生產。

2.3 河豚毒素風險評估現狀

TTX風險評估是對居民日常消費的水產品中TTX含量的一項調查研究。目前,對河豚毒素的風險評估調查較少,而其他水產品包括貝類、魚、蝦、蟹等品種的污染狀況研究卻不見報道。楊雙喜等[37]對寧波市市售水產品TTX污染狀況進行了調查,總體表現為相同品種的水產品,冬春季節毒力含量大;種類差異較大,檢出的主要品種為貝類;陽性率高,但含毒毒力較低。

3 展望

河豚毒素最大的問題是價格較高,其作為Na+通道阻滯劑,獨特的性質在醫藥方面發揮著巨大的作用,由于生物體內TTX含量較低,藥企的原料供應面臨著嚴峻的考驗,導致價格一直居高不下,因此進一步的人工合成也成為了各位科學工作者的研究方向。而安全性是TTX藥物的另一關鍵性問題,國外已經有相應的河豚毒素制劑問世,我國對TTX藥物的研發尚且處于空白狀態。科研人員對藥物的研發包括毒理性、安全評價等重復性實驗,臨床上對安全劑量[38]進行層層把關。一旦以河豚毒素為原料相關藥品惠及大眾,醫學界的許多疑難問題或將迎刃而解。