缺血后適應對大鼠腦缺血再灌注腦組織LC3-Ⅱ、Beclin1及lncRNA表達水平的影響

羅偉力 汪佳兵 韓劍虹 鮑天昊

(臺州市立醫院 1神經內科,浙江 臺州 318000;2藥劑科;昆明醫科大學 3第二附屬醫院神經內科;4附屬精神衛生中心老年病二科)

隨著我國人口老齡化速度的加快,腦血管疾病已成為致死率、致殘率最高的疾病,給家庭和社會帶來了巨大的壓力〔1〕。其中腦卒中的發病率最高,而缺血性腦卒中又占腦卒中的80%～85%。溶栓和取栓等治療方案是治療缺血性腦卒中的有效措施,然而溶栓、取栓后的血液再灌注會進一步導致缺血區組織損傷,即腦缺血再灌注損傷(CIRI),同時會引起顱內出血、腦水腫等嚴重并發癥〔1,2〕。目前的臨床治療當中,CIRI仍然缺乏有效的治療方法和藥物。大腦的缺血后適應(IPostC)是指在恢復永久性的血流再灌注之前,對相應梗死血管采取一定次數的短時間缺血/再灌注循環,以此來提升神經元細胞耐受缺血缺氧能力〔3〕。研究表明,細胞自噬參與上述過程,但IPostC對自噬的調控作用仍然存在爭議〔4〕。研究表明,非編碼RNA與中樞神經系統和神經退行性疾病的病理變化密切相關〔5,6〕。轉錄本長度大于200 nt的長鏈非編碼蛋白RNA(lncRNA)是非編碼RNA的一種重要類型,現今已成為基因表達調控領域的研究熱點〔6〕。但目前IPostC腦組織中的lncRNA變化尚無報道。本文通過大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)后缺血再灌注(I/R)模型及IPostC模型,篩查IPostC模型組中lncRNAs表達差異,并檢測細胞自噬蛋白微管相關蛋白輕鏈(LC)3-Ⅱ和Beclin1在腦組織中的表達變化。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級成年健康雄性SD大鼠,體質量240～280 g,由昆明醫科大學動物實驗中心提供。

1.2主要試劑與儀器 動物栓線購自北京沙東生物技術有限公司;2,3,5三苯基氯化四氮唑(TTC)染液和牛血清白蛋白購自北京索萊寶科技有限公司;抗LC3-Ⅱ抗體、抗Beclin1抗體、GAPDH 均購自英國Abcam公司;羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購自上海碧云天生物技術有限公司;lncRNAs芯片由上海歐易生物醫學科技有限公司提供;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒購自上海快博生物技術有限公司;凝膠成像儀、垂直電泳槽和濕式轉膜槽均購自BIO-RAD公司;定量聚合酶鏈反應(qPCR)儀購自ABI StepOne公司。

1.3動物分組及模型制備 將45只大鼠隨機分為Sham組、I/R組和IPostC組。Sham組只分離血管,不結扎血管、不插入線栓處理,其余操作與I/R 組、IPostC 組相同。I/R 組建立MCAO模型:頸部用75%酒精消毒,在頸部正中位置做1.5 cm切口,然后分離右頸總動脈,頸外動脈和頸內動脈。用動脈夾暫時夾住右頸總動脈和頸內動脈。在頸外動脈切開一個小切口,插入拴線,直到感到阻力為止。固定拴線、松開動脈夾并縫合切口。2 h恢復大腦中動脈血流再灌注,并在恢復血流再灌注24 h取材。IPostC組是在完成MCAO模型后2 h,先給予2 min的血流再灌注,然后給予15 s缺血/30 s血流再灌注的3個循環處理,再恢復大腦中動脈血流永久性再灌注,在恢復永久性血流再灌注24 h,待大鼠蘇醒后進行改良大鼠神經功能缺損(mNSS)評分,mNSS評分總分為18分,重度損傷為13～18分,中度損傷為7～12分,輕度損傷為1～6分,正常為0分。

1.4標本采集 根據各分組處理后24 h,將大鼠進行麻醉,剝去頭皮和附著的肌肉,止血鉗從枕骨處進入,將大鼠顱頂的骨頭撬開并去除,剪斷大鼠大腦底部血管與大腦前端的嗅球,取出腦組織。

1.5TTC染色 大腦組織迅速從大鼠中取出,-20 ℃凍存20 min,冠狀切片切5片,置TTC溶液中,37 ℃下30 min。TTC 染色后,梗死組織為白色,正常組織為紅色。用數碼相機拍攝TTC染色的腦切片,用Image Pro Plus計算大鼠梗死體積。

1.6總RNA提取 腦組織放置在液氮浸沒備用,使用mirVanaTMRNA Isolation AM1561 提取組織中的總RNA:加入裂解結合緩沖液勻漿器混勻,再加入均質添加劑渦旋混勻,冰上放置 10 min。加入酸酚-氯仿-異戊醇混合液,室溫10 000 r/min離心5 min,加入乙醇過純化柱,再離心10 s,清洗純化柱,10 000 r/min離心15 s后加入脫氧核糖核酸酶I和DNA消化緩沖液,室溫放置15 min,再使用洗柱液清洗純化柱,10 000 r/min離心15 s,加入洗脫液或無核酸酶水,室溫最高轉速離心20～30 s,收集管中液體即為提取的總RNA,可放置在-70 ℃保存。

1.7qPCR檢測 大鼠腦組織加入Trizol裂解液,冰浴環境下研磨,靜置裂解,離心10 min后收集上清液并提取總RNA。然后,用逆轉錄酶進行逆轉錄及PCR。通過以下引物分析mRNA的相對水平。引物序列為:LC3-Ⅱ正向:AGTGATTATAGAGCGATA,反向:CTAATTATCTTGATGAGTTC;Beclin1-正向:AAGAGTGTAGAGAACCAGAT,反向:TCGCATTGAAGACATTGG;β-actin-正向TATGGAATCCTGTGGCATC,反向:GTGTTGGCATAGAGGTCTT。通過2-ΔΔCt法計算相對mRNA含量。

1.8Western印跡檢測 大鼠腦組織中加入RIPA 裂解液,充分剪碎組織后,冰浴環境下用超聲細胞破碎儀勻漿,冰浴上靜置裂解,離心10 min后收集上清液。通過二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白質濃度,取適量蛋白樣進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE),凝膠電泳結束后 將凝膠上分離到的蛋白條帶轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%牛血清白蛋白封閉膜,加入一抗(β-actin 抗體,abmart公司)并在4 ℃下孵育過夜,然后加入相應的酶標二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記通用型二抗購自CST公司〕中于室溫孵育2 h。使用電化學發光(ECL)液對條帶進行曝光。使用ImageQuant5.2軟件分析蛋白條帶,計算LC3-Ⅱ和Beclin1 mRNA蛋白相對表達量。

1.9lncRNAs芯片篩查及結果分析 采用Agilent Rat lncRNA V3 (8×60 K,Design ID:084409)芯片,該芯片可檢測27 134條編碼基因和63 542條非編碼基因,可以用來篩查差異表達的lncRNA、lncRNA功能注釋、lncRNA調控機制預測,是lncRNAs信息較全的一款芯片。芯片篩查中RNA的提取、探針的設計及相關圖像的采集和數據的分析等由上海歐易生物醫學科技有限公司提供。采用Gene Ontology數據庫(GO)對差異表達lncRNAs的功能進行分類,并通過 KEGG 數據庫分析差異表達的基因擁有的生物學功能。

1.10統計學方法 采用GraphPad Prism6.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組腦梗死體積檢測 I/R組、IPostC組腦梗死體積明顯高于Sham組,且IPostC組較I/R組有統計學差異(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 每組改良的mNSS評分、梗死體積、LC-Ⅱ和Beclin1 mRNA及蛋白比較

圖1 3組腦梗死組織TTC染色

2.2大鼠mNSS評分檢測 造模2 h后,Sham組沒有任何mNSS表現。I/R組和IPostC組mNSS 評分較Sham組顯著升高(P<0.05),但兩組間mNSS 評分差異無統計學意義(P>0.05)。在對I/R組和IPostC組分別進行永久性缺血再灌注處理和缺血后適應處理24 h后,再次對每只大鼠進行評分。Sham組、I/R組及IPostC組mNSS評分明顯高于Sham組,且IPostC組mNSS評分明顯低于I/R組(P<0.05),說明IPostC組較I/R組的mNSS癥狀有所改善。見表1。

2.3腦組織中 LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA及蛋白水平變化 相比于Sham組,IPostC組和I/R組LC3-Ⅱ和Beclin1 mRNA及蛋白表達升高,具有統計學差異(P<0.05)。IPostC組LC3-Ⅱ和Beclin1 mRNA及蛋白表達水平較I/R組明顯降低(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組腦組織中LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達

2.4腦組織lncRNAs的表達變化 IPostC組和I/R組樣本的lncRNAs 表達明顯不同。進一步對IPostC組中lncRNAs進行顯著性分析,基于上調或者下調倍數變化值≥2.0且P值<0.05,發現其中IPostC組較I/R組存在894條lncRNAs具有差異表達,其中上調的lncRNAs有174條,下調lncRNAs有725條(圖3)。

圖3 腦組織中lncRNAs表達

2.5GO分析和通路富集分析 GO生物學過程分析表明:lncRNA主要集中在胚胎攝像型眼形態發生、心臟右心室形態發生、病毒應答和參與形態發生的細胞凋亡過程;分子組分分析發現:lncRNA主要集中在鈉通道活性、2′,5′寡腺苷酸合成酶活性、LIM結構域結合和單鏈RNA結合方面;同時膜的整體成分、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、頂端質膜、蛋白類細胞外基質是lncRNA主要集中的細胞組分。這些差異表達的轉錄本多與凋亡和RNA調節等相關。KEGG通路富集分析。結果顯示,差異表達的轉錄本在10條通路中顯著富集,其中多數lncRNA富集在以下4條通路中:1型糖尿病、青年發病的成年型糖尿病、單純皰疹感染、細胞黏附分子。見圖4、圖5。

圖4 差異表達轉錄本GO生物學過程分析和GO分子組分分析

圖5 差異表達轉錄本GO細胞組分分析和KEGG通路富集分析

3 討 論

溶栓和取栓是缺血性腦卒中血栓性腦梗死的主要治療手段〔1〕。溶栓、取栓后的再灌注會給腦部帶來二次損傷。再灌注損傷涉及氧化應激損傷、炎癥因子損傷、鈣離子超載等多種機制〔1,2〕。目前對缺血再灌注損傷的臨床治療仍然缺少有效的治療方法和藥物。研究表明,IPostC是激活內源性神經保護的一個新策略,IPostC能促進神經生長因子、神經營養因子等保護性物質的產生或增多〔3〕。有研究結果顯示,大鼠經在IPostC處理后,腦組織中的抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤(Bcl)-2和促進神經元生長相關蛋白(GAP)-43蛋白表達水平在明顯增加〔7〕,說明IPostC在缺血性腦卒中的治療方面具有巨大潛能。本研究說明,IPostC在腦的缺血再灌注損傷中提供腦保護效應。

細胞自噬普遍存在于真核細胞生物中,是細胞進行自我吞噬的一種表現,其中自噬與IPostC的密切相關。實驗發現,IPostC能夠激活內源性保護通路,抑制缺血后自噬活化,大鼠神經功能障礙和再灌注損傷都得到一定程度的改善〔8〕。有研究也發現,IPostC通過減少細胞內自噬而減輕腦缺血再灌注損傷,可能與增強mTOR作用有關。有實驗表明,IPostC在3 h時神經保護作用不明顯,隨時間延長對自噬作用的抑制增強,對神經元的保護作用明顯增強,且發現自噬相關基因表達具有時間依賴性〔10〕。本研究結果顯示,IPostC通過下調 LC3-Ⅱ和Beclin1的表達,降低細胞自噬水平,保護缺血再灌注帶來的損傷,與上述研究結果一致。但是,研究〔11〕發現,IPostC能抑制P38/MAPK 通路的活性,提高自噬相關基因的表達,從而對缺血腦組織產生保護作用。石秋艷等〔12〕也發現,IPostC 組的自噬相關蛋白表達細胞數、自噬體形成及溶酶體激活量等顯著增加,而大鼠神經行為學評分降低、神經功能缺損得到改善,提示IPostC可能通過上調自噬活性以對抗缺血再灌注損傷。因此,自噬在IPostC的作用較為復雜,需要進一步的研究。

研究證據顯示,lncRNAs具有重要的生物學功能,可能參與調控許多疾病發展的病理過程,但其在IPostC中尚無報道〔6〕。本文發現在大鼠局灶性腦組織缺血缺氧后采用IPostC手段,腦組織 lncRNAs的表達譜較直接血流再灌注發生顯著變化。但本研究只是初步表明,相對于I/R組,IPostC組中的lncRNAs表達存在較大的差異,仍需要進一步研究具體的lncRNAs及所介導的細胞及分子作用機制。

綜上,IPostC減少自噬而減輕腦缺血再灌注損傷,同時IPostC可能通過 lncRNAs對腦缺血再灌注損傷起到保護作用。