人羊膜上皮細胞對心肌梗死微循環重建的影響

張強 李長春 劉敏 尹熙惠 洪蘭 方成虎

(1延邊大學附屬醫院,吉林 延吉 133000 ;2上海市虹口區江灣醫院(上海健康醫學院附屬第一康復醫院);3延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室)

急性心肌梗死(AMI)是供應心臟血流的冠狀動脈發生急性閉塞〔1〕。由于血管中斑塊、白細胞、膽固醇和脂肪的不穩定積聚,使血液停滯或不能正常流向心臟的某個部位,造成該冠狀動脈供血區域的心肌細胞發生損傷、壞死。由于心肌細胞是終末分化細胞,壞死后不可再生,壞死部分心肌功能逐漸減弱,因此,挽救瀕死心肌以縮小梗死面積成為AMI治療的關鍵。在臨床工作中,再灌注治療依然是目前AMI患者治療的主要方法,包括靜脈溶栓、冠狀動脈支架植入術和冠狀動脈旁路移植術,以恢復冠脈血流,使缺氧、缺血的心肌細胞得以存活。無法及時接受再灌注治療或再灌注治療失敗的患者,由于存活心肌細胞的減少往往會發生心肌不良重塑和充血性心力衰竭,甚至死亡。據報道,因為出凝血功能障礙、腎功能衰竭等各種原因,一些患者只能接受保守治療,卻仍然表現出較高的存活率〔2〕。究其原因,可能為某些心臟細胞在某種物質的參與下,進一步分化為血管樣細胞并形成新生毛細血管的結果,這引發了壞死心肌局部微循環的重新建立〔3〕。在微循環重新建立后,新生的血管以通暢血流營養缺血、缺氧的心肌細胞,維持心臟的生理功能。有趣的是,這種情況通常發生在前降支、回旋支和右冠狀動脈三支血管均堵塞的患者身上,并在嚴格后續治療后發現患者日常生活未受明顯限制。這提示促進AMI后微循環建立將有助于保護殘存心肌細胞的結構和功能。問題是,這種血運重建并不是所有患者都發生,也可能發生的時間較晚。因此,尋求一種促進梗死后微循環重建的方法顯得至關重要。細胞替代治療作為一種獨創性的治療手段及其廣大的應用前景引起了臨床和基礎醫學工作者的廣泛存眷〔4〕,已成為再生醫學中最有前途的領域之一,其核心觀念即通過將患者自體或異體細胞移植入受損組織或器官,最終實現缺失部位的替代和功能的修復。中外學者研究發現胚胎干細胞〔5〕、臍帶血間充質干細胞〔6〕、人脂肪組織微血管內皮細胞〔7〕等均可誘導心肌組織間隙毛細血管生成。這些干細胞具有來源廣泛、容易體外分離、培養及擴增等優點,但也存在諸多問題,如社會倫理爭議、細胞之間的免疫排斥反應、致瘤性、療效不確定性等〔8〕。因此,開發一種能解決上述不足之處的理想細胞來源,便成為當前細胞治療研究的熱點。人羊膜上皮細胞(hAECs)克服了以上細胞的缺點,以其廣泛可用性、干細胞特性、低免疫源性、分化可塑性、無致瘤性、容易獲取且不涉及倫理問題等優點,成為細胞替代治療AMI的一個新的發展和研究熱點,近10年來受到了越來越多的關注。本文將圍繞 hAECs在AMI后微循環重建中的作用及具體機制展開綜述。

1 hAECs的簡述

hAECs來源于胎盤羊膜組織,且來源于內細胞團,是胚胎細胞,由于在器官發生過程中沒有直接受到分化信號的影響,因此可能保留外胚層干細胞樣特征和體外三期分化能力〔9,10〕。并且明顯具有成熟上皮細胞的許多表型特征,包括細胞角蛋白表達和細胞間緊密連接的形成,能夠封閉羊膜腔,幫助維持羊水的成分。hAECs具有表達干細胞標志分子及相關基因的特性,林海等〔9〕通過細胞免疫熒光標記發現hAECs表達階段特異性胚胎抗原(SSEA)-3、SSEA-4、腫瘤排斥抗原(TRA)-1-60和TRA-1-81等,運用逆轉錄-實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測出其可表達干細胞全能性相關基因八聚體結合蛋白(OCT)-4、染色體相關性別決定區(SOX)-2、抑制性突變體(Nanog)、遺傳變種基因(REX)-1、纖維母細胞生長因子(FGF)-4及端粒酶逆轉錄酶(TERT)等,這些表達結果顯示hAECs具有部分干細胞特性,具有明顯的可塑性及多項分化潛能,同時證明hAECs不表達干細胞中端粒酶基因,說明其不可以無限增殖,具有非致瘤性,因此,其在臨床治療中安全性更高。大量研究證實,hAECs在不同生長因子的調節下,可分化為肝樣細胞〔11〕、心肌樣細胞〔12〕、神經元細胞〔13〕及胰島樣細胞〔14〕等,在細胞替代治療及組織再生醫學上有廣闊的應用前景。

2 hAECs治療MI的潛力

Fang等〔12〕將表達上皮細胞特異性標記pan-cytokeratin的hAECs移植入由液氮制造的AMI大鼠模型后,經過一個月的人工飼養后對大鼠心臟進行切片分析發現,部分hAECs可分化為表達心肌細胞特異性標記肌球蛋白重鏈(MHC)的心肌樣細胞,通過免疫組化及分子生物學分析等實驗證實,分化后的細胞有效減少了心臟梗死面積,通過正電子發射型計算機斷層顯像(PET)及超聲心動圖等可發現心臟功能得以部分恢復。王鈺瑩等〔15〕將hAECs移植到左前降支結扎的大鼠模型中,發現hAECs移植組存活的心肌細胞數量較AMI模型組梗死區的更多,心肌細胞纖維化程度更小,左心室重構程度與其相比明顯減輕、延緩。但Fang等〔12〕對AMI大鼠模型的細胞移植中,僅有3%的hAECs轉化為心肌樣細胞,由此可見數量不多的心肌樣細胞有可能并不是改善心功能的關鍵因素,且并未闡明其改善心肌功能的具體作用機制,故hAECs作為一種新型治療AMI的途徑其機制還有待進一步研究證實。

3 hAECs及人羊水來源干細胞來源的內皮細胞(AFSC-EC)對梗死后微循環的影響

Benavides等〔16〕以纖維蛋白-聚乙二醇水凝膠為細胞包封平臺,其可促進生物相容性、機械穩定性和血管生成;在共培養中,AFSC和hAECs各作為一種支持細胞來源,類似于間充質干細胞(MSC),發現其能夠促進血管長度、面積和厚度的增加;AFSC和hAECs共同衍生的細胞網絡清晰形成,血管厚度和覆蓋面積與人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)-MSC衍生的網絡相似,但還需要進一步的分析來確定血管成熟度和體內活力的潛能。Lloyd-Griffith等〔17〕通過對AFSC-HUVEC共培養用于體外膠原蛋白硫酸軟骨素(CCS)支架內生成微毛細血管樣結構網絡,AFSC可發揮周圍細胞樣細胞的作用,以穩定微毛細血管結構的形成。但其研究發現,缺氧條件對微毛細血管樣結構的形成無有利影響,常氧促進了3種O2濃度條件下微毛細血管樣結構的形成。這項研究是首次使用含有AFSC的共培養方法成功的預血管化CCS支架(或任何多孔支架)。總的來說,本研究驗證了基于AFSC和hAECs的共培養用于血管形成前具有促進作用。

3.1hAECs及AFSC-EC可分化為血管內皮細胞 Liu等〔18〕通過局部肌內將AFSC-EC移植于裸鼠缺血后肢,明顯增加血流灌注,治療效果明顯(搶救出11/13只肢體)。這種AFSC-EC在缺血組織中移植的好處可能不是與供體細胞融合或轉分化血腦屏障的結果,而是由于新生血管的形成,重新構建缺血部位的微循環,在缺血區域肌內注射AFSC-EC改善了保肢,恢復了血液灌注,顯著增加了毛細血管和小動脈密度。此外,移植的AFSC-EC分化為成熟的內皮細胞或平滑肌細胞并融入血管,進而促進包括小動脈在內的新血管的形成。因此,AFSC-EC可能是缺血性疾病再生治療的一種選擇,即可用于AMI的患者,使其壞死區域毛細血管再生,重新構建微循環,使患者心臟功能得以部分恢復。Fazel等〔19〕強調了血運重建的必要性,報道骨髓源性祖細胞通過促進新生血管生成,顯著增強心臟修復。因hAECs是比AFSC起源更早的細胞,故其保留較多干細胞特性,因此其也對血管再生機制有著廣闊的前景。

3.2hAECs及AFSC-EC的旁分泌因子對血管再生的影響 一些研究表明〔20〕,hAECs表達一些抗血管生成的化學物質,包括血栓反應素-1,內皮抑素和硫酸肝素蛋白聚糖。此外,所有4種金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1,-2,-3和-4都存在于hAECs中,其具有強大的抗血管生成作用。另一方面,也有報道指出hAECs分泌一些血管生成因子,如血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素(IL)-8 、血管生成素、干擾素、IL-6、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和血小板源性生長因子(PDGF)等〔21〕。基于這些數據,hAECs可以同時具有血管生成和抗血管生成的特性。hAECs誘導血管生成可以用血管生成因子解釋,包括:VEGF、IL-8、IL-6、生長相關癌基因(GRO)、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、血管內黏附分子(ICAM)和遷移抑制因子(MIF),這些因子都是由hAECs及AFSC-EC分泌的〔22〕。當羊膜分泌的生長因子如成纖維細胞生長因子(FGF)、轉化生長因子(TGF)-β、EGF、角質細胞生長因子、肝細胞生長因子等存在時,間充質細胞可分化為內皮細胞。因此,羊膜除了分泌多種血管生成因子外,還可通過間充質細胞向內皮細胞分化,促進血管生成。

旁分泌因子在細胞治療中起關鍵作用。通過大量文獻及研究可知通過局部控制細胞因子濃度,持續向缺血組織輸送旁分泌因子對治療有好處〔23〕。然而,Liu等〔18〕觀察到1個單一肌內注射AFSC-EC上清液并不能改善缺血的保肢或局部血流,說明該治療不能有效地誘導治療性血管生成。這種辦法失敗的根本原因仍待探討。AFSC-EC上清液可能會被迅速清除,而不會在缺血區域停留足夠長的時間以誘導血管生成。提高AFSC-EC上清液治療效果的策略,如反復肌內注射缺血組織和使用肽納米纖維控制輸送,需要進一步的研究。金屬蛋白酶系統(MMPs)已被證明參與了新生血管的形成過程〔24〕。雖然Kim等〔25〕表明MMP-3和MMP-9的表達在MSC的血管生成中起著重要作用,但并沒有確定可能參與血管生成通路的因素。VEGF-α在血管生成中起關鍵作用。已有多篇報道討論了VEGF-α與MMP-3或MMP-9相互作用的可能性〔26〕,但這些分子相互作用的機制尚不清楚:研究表明,MMP-9刺激VEGF表達〔27〕,而另一些研究認為MMP-9被VEGF激活〔28〕。其研究發現,添加MMP-3或MMP-9抑制劑顯著抑制體外毛細血管樣血管的形成。MMP-9抑制劑治療減少了VEGF-α的釋放,但MMP-3抑制劑治療增加了VEGF-α的水平。表明MMP-9可能刺激AFSC-EC釋放VEGF-α,從而誘導新生血管,而MMP-3則相反,可能受到VEGF-α的調控,從而誘導血管生成。然而,AFSC-EC治療作用的機制尚不完全清楚。事實上,AFSC-EC誘導血管生成和動脈生成的改善可能有多種機制。Cohen等〔29〕研究表明,IL-6在血管生成中的作用是通過誘導VEGF,是一種有效的血管生成因子。Song等〔30〕通過研究表明,h-AECs 分泌細胞因子包括血管生長素(ANG)、EGF、IL-6、MCP-1等,這些細胞因子在大鼠MI模型中能夠有效地參與心肌修復和功能改進,故進一步研究這些分泌因子的作用機制對開發新型分子療法治療MI具有重要意義。

綜上,血管生成是一個復雜的過程,成熟的內皮細胞具有有限的再生能力。研究表明,移植的AFSC-EC在缺血的小鼠組織中存活,增加了毛細血管和小動脈的密度,并直接并入缺血部位的小動脈(內皮和平滑肌層)。缺血肢體血流灌注改善可能是缺血部位新生血管的誘導所致。因此,該研究證明了被移植的AFSC-EC在體內分化為成熟的內皮細胞或平滑肌細胞,并融入血管,進而促進包括小動脈在內的新血管的形成。AFSC和hAECs在特定的培養基中培養時能夠分化為ECs,AFSC-ECs在基質上形成毛細血管樣網絡結構。重要的是,研究表明,移植的AFSC-ECs在缺血組織中存活,增強新生血管生成,融入血管組織,改善缺血區域的血液灌注。h-AECs 分泌細胞因子能夠有效地參與心肌修復和功能改進,本文認為AFSC-ECs和h-AECs可以作為一種新的異種移植細胞來源,用于治療缺血性疾病的血管生成。雖然 h-AECs 細胞替代治療研究至今在臨床前實驗研究上沒有大的進展,但為MI后的缺血再灌注治療提供了更多參考方案,其在MI治療的研究潛力是不可估量的。相信其后續研究能有更大進展,并應用到真正的臨床實踐中。