基于斑塊穩定性對比青年與老年ApoE-/-小鼠冠狀動脈粥樣硬化的特點

張悅 舒劉芳 孫英新 姜希娟 王一婧

(1天津中醫藥大學,天津 301617;2佛山市南海區人民醫院;3天津體育學院社會體育與健康科學學院)

隨著全球大多數國家步入老年化社會,以動脈粥樣硬化(AS)為基本病理特征的冠心病發病率逐年上升。據世界衛生組織(WHO)調查結果顯示,盡管近年來發生AS的人群越來越趨向年輕化,但老年人仍是急性心血管事件發生的主要群體〔1〕,81%的心血管病患者死亡年齡>65歲〔2〕。隨著年齡增加,AS的危險因素如高血壓、糖尿病、高脂血癥等發病率顯著增加。以上研究提示年齡對AS的發生發展有重要影響。

AS斑塊的穩定性與斑塊纖維帽厚度、脂核大小、浸潤的炎細胞數量等密切相關〔3〕。AS斑塊局部發生的炎癥反應及細胞外基質降解等病理變化,常可導致斑塊內出血、斑塊破裂等一系列嚴重繼發性改變。衰老是AS發生的獨立危險因素〔4〕,可促進AS的發生發展。隨著年齡增長,AS斑塊局部的炎癥細胞、炎癥因子和趨化因子等的比例發生變化,提示不同年齡段AS發生的病因、病變及其主要機制存在差異。本實驗以載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠冠狀AS模型為研究對象,觀察老年與青年小鼠冠狀AS形態學差異,并在此基礎上進一步分析青年與老年ApoE-/-小鼠AS斑塊穩定性的相關指標差異及存在差異的可能機制,為未來臨床針對AS個體化治療方案的選擇提供理論和科學參考依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8周齡、32周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠及相同遺傳背景及匹配周齡C57BL/6J小鼠,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物生產許可證號:SCXK(京)2014-0004。

1.2實驗飼料 高脂飼料(21%乳脂+0.15%膽固醇),批號MD12015,購于江蘇美迪森生物醫藥有限公司。

1.3實驗試劑 總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和油紅O試劑盒購于南京建成生物工程研究所;單核細胞趨化蛋白(MCP)-1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒購自武漢Cloud-Clone Crop;Masson染色試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司;CD68、細胞間黏附分子(ICAM)-1和血管細胞黏附因子(VCAM)-1兔單克隆抗體購于美國abcam公司;基質金屬蛋白酶(MMP)9兔多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)小鼠單克隆抗體購于萬類生物科技;ICAM-1和VCAM-1引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4模型分組與制備 以8周齡C57BL/6J野生型小鼠作為青年對照(QC)組,以32周齡C57BL/6J 野生型小鼠作為老年對照(LC)組,以8周齡 ApoE-/-小鼠作為青年模型(QM)組,以32周齡 ApoE-/-小鼠作為老年模型(LM)組。適應性飼養1 w后,采用高脂飼料喂養模型組,用普通飼料喂養對照組,實驗周期共28 w,建立ApoE-/-小鼠冠狀動脈AS模型。

1.5體質量觀察及評價AS斑塊 在造模過程中,每周觀察體質量變化。實驗干預28 w結束后,用乙醚麻醉小鼠,采用小動物彩超儀檢測主動脈弓,以評估動脈AS斑塊的形成。

1.6血清學指標檢測 實驗干預28 w結束后,獲取血清,參照說明書,分別采用微板法檢測TG、TC、LDL-C、HDL-C水平,ELISA法檢測MCP-1水平。

1.7冠狀動脈斑塊蘇木素-伊紅(HE)、Masson和油紅O染色觀察 預冷生理鹽水灌流去除血管內殘余血液,取主動脈根部平面的組織,部分于甲醛溶液固定或冰凍,常規石蠟或冰凍連續切片,分別行Masson、HE和油紅O染色。用 Leica Qwin Image Processing and Analysis 軟件分析切片染色結果,測量主動脈根部水平冠狀動脈主干處 AS斑塊面積、膠原纖維含量和斑塊內脂質含量。

1.8免疫組織化學法檢測CD68及MMP9在冠狀動脈AS斑塊中的表達 石蠟切片常規脫蠟至水,行免疫組化染色,使用IPP圖像分析軟件分析免疫組化染色結果,測量主動脈根部水平冠狀動脈主干處AS斑塊面積(PA)、斑塊內陽性表達面積/陽性細胞總數,計算斑塊內陽性面積的百分比(陽性面積/PA)。

1.9石蠟切片普魯士藍染色檢測冠狀動脈斑塊內出血情況 石蠟切片常規脫蠟至水,參照普魯士藍染色檢測說明書進行。待切片干燥后顯微鏡下拍片,用Leica Qwin Image Processing and Analysis軟件分析普魯士藍染色結果,測量PA、計數斑塊內出血點總數,計算斑塊內校正出血點百分比(斑塊內出血點總數/PA)。

1.10RT-q聚合酶鏈反應(PCR)法檢測主動脈 ICAM-1 及 VCAM-1 RNA表達 裂解液裂解主動脈,RNA提取試劑盒提取總RNA,測定其濃度和純度,按照試劑盒要求反轉錄為cDNA。ICAM-1 及 VCAM-1為目的基因,GAPDH為內參基因,引物序列(5′→3′):GAPDH上游引物:GTTACCAGGGCTGCCTTCTC,下游:GATGGTGATGGGTTTCCCGT;ICAM-1上游引物:TTCACACTGAATGCCAGCTC,下游:GTCTGCTGAGACCCCTCTTG;VCAM-1上游引物:ATTTTCTGGGGCAGGAAGTT,下游:ACGTCAG-AACAACCGAATCC。長度分別為177、182、238 bp。擴增條件為95 ℃預變性15 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火 30 s,最后72 ℃延伸30 s。

1.11Western印跡法檢測主動脈 ICAM-1 及 VCAM-1 蛋白表達 主動脈勻漿,試劑盒提取主動脈總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量均一,100 ℃水浴10 min蛋白變性。聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳,轉膜,加入ICAM-1(100 kD,1∶5 000)、VCAM-1(100 kD,1∶5 000)和β-actin(42 kD,1∶1 000)一抗過夜,后加入相應二抗,顯影,凝膠成像并用分析系統分析。

1.12統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行LSD-t檢驗,檢驗水準(α)為 0.05。

2 結 果

2.1小鼠超聲與體質量變化 實驗干預 28 w結束后,超聲圖結果顯示:兩模型組主動脈及頸動脈均可見明顯斑塊形成,而同年齡段對照組無或少見斑塊。兩模型組高脂飲食 28 w后,體質量較普通飲食喂養的相應對照組體質量明顯增加(均P<0.01),LM組較QM組體質量增加更明顯(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組體質量、血清TC、LDL-C、HDL-C、TG、MCP-1水平比較

圖1 超聲心動圖示各組主動脈弓及頭臂干處斑塊

2.2各組血脂及MCP-1水平比較 由表1可知,兩模型組在高脂飲食28 w后,血清TC、 LDL-C和TG水平均明顯升高,分別和同年齡段對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)。LC組血清 TG水平較QC組顯著低(P<0.01),LM組血清 TG水平較QM組顯著高(P<0.05)。LM組與QM組、LC組與QC組相比血清 HDL-C 有降低趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比,同年齡段模型組血清 MCP-1含量均明顯升高(P<0.01);LC組與QC組相比,血清MCP-1水平顯著低(P<0.01),QM組與LM組血清MCP-1水平無明顯差異(P>0.05)。

2.3各組冠狀動脈HE染色與油紅O染色結果 HE染色結果顯示,QC組血管管壁結構規則,內膜平滑、中膜厚度均一,管腔完整;LC組血管管壁較疏松,管腔較完整;QM組血管管壁部分結構凌亂、彈性膜結構破壞,管壁內可見AS斑塊,其纖維帽完整;LM組冠狀動脈管壁結構明顯紊亂,管腔狹窄,彈性膜結構明顯減少,內膜明顯增厚。兩對照組均無斑塊形成,LM組較LC組主動脈根部水平斑塊面積及脂質含量明顯增大(均P<0.01)。油紅O染色顯示,與對照組相比,兩年齡段模型組冠狀動脈斑塊中均有大量脂質沉積。LM組與QM組相比,冠狀動脈斑塊中斑塊脂質含量少(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 各組斑塊面積和斑塊脂質含量比較

圖2 各組冠狀動脈形態

2.4兩模型組冠狀動脈斑塊中膠原纖維含量、CD68、MMP9及出血點的表達差異 Masson染色顯示兩模型組冠狀動脈斑塊中均有大量膠原纖維沉積,且LM組較QM組冠狀動脈斑塊中膠原纖維含量百分比明顯減少(P<0.05)。免疫組化染色顯示,LM組冠狀動脈斑塊中CD68及MMP9含量與QM組相比顯著增高(均P<0.01)。普魯士藍染色顯示QM組冠狀動脈斑塊出血點百分比較LM組明顯升高(P<0.01)。見表3、圖3。

表3 兩模型組冠狀動脈斑塊膠原纖維、CD68、MMP9含量和出血點比較

圖3 兩模型組冠狀動脈Masson、CD68、MMP9和Perls染色(×400)

2.5各組主動脈組織中 ICAM-1 及 VCAM-1表達差異 與同年齡段對照組相比,LM組與QM組冠狀動脈 ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.01,P<0.05);ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達在QM組與LM組、QC組與LC組之間差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)。ICAM-1蛋白表達在QM組與LM組之間差異有統計學意義(P<0.05),VCAM-1 蛋白表達在LM組與QM組間無統計學差異(P>0.05)。見表4、圖4。

表4 各組主動脈ICAM-1、VCAM-1 mRNA和蛋白表達比較

圖4 Western印跡檢測各組主動脈ICAM-1、VCAM-1蛋白表達

3 討 論

全球老年化人口在未來幾十年中將大幅增長,預測到2050年,65歲以上的人數將翻一番,這提示與年齡有關疾病將出現不可避免的激增〔5〕。衰老被認為是一種慢性無菌低度炎癥狀態(也被稱為炎癥性衰老),在大多數慢性退行性疾病(包括老年性心血管疾病和腦血管疾病)的發展中起重要作用〔1〕。眾多炎癥細胞參與AS進程,而其中具有清道夫之稱的單核/巨噬細胞更是參與了 AS 的全程,在AS早期階段,其可通過攝取正常和氧化修飾性的脂蛋白減輕局部損害,但隨著胞內脂質增多,其逐漸轉化成泡沫細胞,單核/巨噬細胞原有細胞表型和功能也發生了改變〔6,7〕,本實驗通過免疫組化對冠狀動脈AS斑塊內的巨噬細胞 CD68 進行定位定量分析,發現衰老對AS斑塊內炎細胞的聚集有促進作用。MCP-1表達增多可誘導單核巨噬細胞、淋巴細胞等炎細胞向血管壁局部病變定向遷移、浸潤及活化,活化的巨噬細胞可進一步分泌炎癥因子促進AS 的進展,與冠心病密切相關〔8〕。本實驗證實,MCP-1水平與 AS的形成密切相關,但在同等高脂飲食條件下不同年齡小鼠MCP-1 水平尚不足以形成顯著差異。

ICAM-1和 VCAM-1 是介導炎細胞黏附的兩個重要黏附分子。研究表明,ICAM-1、 VCAM-1等高表達促進巨噬細胞在斑塊中大量增殖積累,增加斑塊不穩定性〔9〕。研究發現,老年大鼠(24月齡)血清中的ICAM-1和VCAM-1都顯著高于青年大鼠(6月齡),這表明這些黏附分子的系統性表達可能會增加炎癥性血管疾病的風險〔10〕。本實驗也證實,隨著年齡增大,小鼠ICAM-1和VCAM-1 mRNA 表達增加,支持了 ICAM-1、VCAM-1 是參與AS 形成的主要事件之一的觀點,但關于 VCAM-1 的年齡相關性變化仍不明確。Fotis等〔11〕研究證實,高膽固醇飲食可誘導 Wistar 大鼠主動脈中 ICAM-1 的表達增加,而對 AS 早期階段 VCAM-1 的表達無明顯影響,這提示主動脈中ICAM-1表達可能是AS病變的早期事件,而VCAM-1可能在AS后期表達,這也與實驗結果相符,而LM組冠狀動脈 VCAM-1 蛋白表達與LC組比有升高趨勢,但無顯著性差異,考慮與冠狀動脈組織蛋白提取時混有部分心肌蛋白相關。

本研究還發現,老年模型組斑塊中MMP9表達增高。研究表明,MMPs 在易損 AS 斑塊進展中起著關鍵作用〔9〕,其中MMP9更是調節動脈細胞外基質含量的主要成分,其可降解細胞外基質,并促進平滑肌細胞的增殖和遷移〔12〕,其活性失衡可以導致血管的病理性改變。Masson染色結果與MMP9的結果相符合。結合HE 染色結果,本研究提示,斑塊內脂質沉積與斑塊大小呈正相關,且年齡對其有一定的促進作用。另發現,兩模型組小鼠冠狀動脈 AS 斑塊內出血點密度有差異,但以青年模型組較多,即青年模型組小鼠較老年模型組小鼠冠狀動脈 AS 斑塊更易出血,但其原因仍不清楚,可能與血管新生的能力隨年齡增加而減弱有關。

綜上所述,老年與青年 ApoE-/-小鼠冠狀動脈AS斑塊組織形態學及穩定性相關指標存在差異,這表明在相同環境下,老年與青年ApoE-/-小鼠AS病變進程也并不完全相同。老年ApoE-/-小鼠AS斑塊的不穩定性主要與內外膜炎癥反應、細胞外基質降解有關,而青年 ApoE-/-小鼠AS斑塊的不穩定性則主要與斑塊內出血密切相關。至于斑塊內出血在青年鼠冠狀動脈AS斑塊中更突出的原因尚有待進一步研究。