阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠認知障礙與海馬區小膠質細胞的關系

劉仁帥 羅憫 殷梅

(昆明醫科大學第二附屬醫院神經內科,云南 昆明 650101)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是一種與睡眠相關的常見呼吸障礙〔1〕。作為 OSAS的常見并發癥,認知障礙近年來備受關注〔2〕。OSAS對認知功能的影響包括注意力和警覺性降低、記憶力和學習能力受損、精神運動功能失衡、情緒調節紊亂和執行功能下降等〔3〕。小膠質細胞是中樞神經系統血管化、炎癥和神經保護的關鍵因素〔4〕,激活的小膠質細胞與OSAS患者神經炎癥的發展和維持有關。小膠質細胞特別容易因腦損傷和炎癥或免疫刺激而被激活,并在激活后發生顯著的形態學改變,從靜止的分枝小膠質細胞變成激活的似變形蟲的小膠質細胞。在這個激活過程中,它們的表面分子(如補體受體、細胞因子、趨化因子等)將上調,同時,具有促炎性和潛在細胞毒性的多種可溶性因子,釋放激活的小膠質細胞〔5～7〕通過受損的線粒體、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和產生過量一氧化氮來誘導強大的氧化應激反應〔8〕,從而加重慢性間歇性缺氧(CIH)損傷,導致認知障礙。作為OSAS最重要的病理生理過程,CIH會導致中樞神經系統的結構性神經元損傷和功能障礙,這很可能與海馬體有關〔9〕,但具體機制尚不完全清楚。本研究建立OSAS大鼠動物模型,觀察海馬CA1區病理變化及小膠質細胞激活情況,尋找OSAS認知障礙可能的機制。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑 多參數神經監護儀(上海諾誠醫療器械公司);Morris水迷宮(成都盟泰科技有限公司);組織脫水機(闊?？萍?KH-TK);石蠟包埋機(Leica EG1160,德國);石蠟切片機(Leica RM2135,德國);冰凍切片機(Leica CM 1900,德國);數碼成像及分析系統(CellSens Standard);10 mg/ml玻璃酸透明質酸鈉凝膠(上海其勝生物制劑公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,北京中杉 ZLI-9061);Tween 20(Sigma-vetec);聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100,Vetec V900502);檸檬酸鹽修復液(北京中杉金橋);蘇木素(Sigma H3136);伊紅(Sigma 230251);石蠟(Leica H22149);二氨基聯苯胺(DBA)顯色試劑盒(北京中杉ZLI-9018);封閉用正常羊血清(北京中杉ZLI-9021);通用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋);離子鈣接頭蛋白抗原(IBA)-1(wako日本 rabbit)。

1.2實驗動物 健康雄性SD大鼠60只,體質量280～300 g,購自昆明醫科大學實驗動物學部〔生產許可證:SCXK(滇)K2015-0002)〕,在昆明醫科大學實驗動物樓標準化飼養,保證實驗大鼠正常生活習性。本實驗得到昆明醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.3實驗動物及分組 適應性喂養后采用隨機數字表法將60只大鼠隨機分為對照組和實驗組各30只。對照組采用正常飼養模式,實驗組采用咽腔多點注射透明質酸鈉凝膠制備OSAS模型。

1.4OSAS動物模型制作 根據周趙德等〔10〕方法,(1)SD大鼠均適應性飼養1 w后,使用多參數神經監護儀監測血氧飽和度并記錄數據(具體方法為:按3 ml/kg的劑量配制10%水合氯醛,對大鼠進行腹腔注射麻醉;成功后,將血氧探頭的紅外線充分接鼠尾靜脈,待儀器上參數穩定后記錄每只大鼠的最低血氧飽和度和平均血氧飽和度)。(2)實驗組模型制備方法為:麻醉方法同以上,于雙側舌腭弓、咽腭弓及舌根處多點少量注射醫用透明質酸鈉凝膠(約3 ml),整個過程注意觀察大鼠呼吸情況。小心監測大鼠生命體征,直至大鼠麻醉完全清醒,避免窒息死亡。分別于術前1 w及術后4 w使用多參數神經監護儀監測最低血氧飽和度及平均血氧飽和度,并與術前數據進行統計學分析。(3)實驗分組:30只模型組大鼠造模成功后,按繼續飼養時間分為實驗2、4、6 w組,每組10只,與對照組相對應。

1.5Morris水迷宮試驗行為學評估 ①定位航行實驗:第1～6天對大鼠進行水迷宮檢測,第1天為適應性訓練。實驗開始時小平臺放置于第三象限且在水面下1～2 cm。將兩組大鼠分別在每個象限的中點面朝池壁置放入水槽,同時啟動計算機跟蹤程序,記錄每組大鼠在水迷宮中找到水下平臺所花費的時間、路程,超過90 s未找到平臺時其潛伏期記為90 s,同時實驗者用小棍指引大鼠尋找到平臺,并允許其在小平臺上停留10 s。取每只大鼠的平均成績作為空間學習能力的指標,連續觀測6 d。②空間探索實驗:第7天將小平臺撤去,分別在四個象限的固定點將大鼠放入水池,記錄大鼠在目標象限的時間及穿過原平臺所在位置的次數,將此作為空間記憶的檢測指標。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組海馬CA1區病理學改變 所有大鼠脫頸處死后,快速分離海馬組織并制備石蠟切片,將切片在二甲苯中脫蠟10 min,然后在降序的乙醇(100%、95%、85%和70%)和蒸餾水中再水合5 min。切片用0.1% HE溶液染色,然后在95%和100%乙醇中逐漸脫水2次,每次5 min。處理脫水后,中性樹膠封片,普通光學顯微鏡下觀察顯色結果并拍照。

1.7免疫組組織化學(IHC)檢測小膠質細胞標記物IBA-1的陽性表達 將切片置于溫度為65 ℃恒溫烘箱中至少30 min,常規梯度乙醇脫蠟至水,0.01 mol/L PBS漂洗,將腦組織切片浸入3%過氧化氫(H2O2)溶液在室溫下放置30 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。然后將組織切片置于檸檬酸鹽緩沖液中在微波爐中進行抗原修復。在室溫下再加入正常山羊血清1 h以阻斷非特異性結合,加適當濃度一抗,4 ℃過夜。PBS洗滌20 min后,組織切片與二抗(PV9000試劑)37 ℃孵育30 min。然后去除多余的二抗,再用PV9000試劑25 ℃孵育1 h,PBS漂洗后用DAB染色5～10 min。顯微鏡下觀察顯色情況并記錄顯色時間,然后將組織切片用蘇木素復染,烘干,二甲苯透明10 min,中性樹膠封片,照片采集。

1.8統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行自身配對設計t檢驗、重復測量方差分析、單因素方差分析及Pearson相關分析。

2 結 果

2.1造模成功判斷 造模后實驗組出現活動減少、呼吸費力、呼吸頻次增快、抬頭呼吸、腹式呼吸加深,可聞及呼吸打鼾聲等類似OSAS癥狀。對照組性情溫順、呼吸正常、活動及飲食正常。實驗組造模后最低血氧飽和度及平均血氧飽和度均較造模前降低,差異均具有統計學意義(P<0.05),提示造模成功。見表1。

表1 實驗組造模前后最低血氧飽和度和平均血氧飽和度

2.2Morris水迷宮行為學結果

2.2.1定位航線實驗 實驗組2、4、6 w平均潛伏期較對照組延長,差異有統計學意義(P<0.05),且隨著實驗組培養時間延長,潛伏期逐漸延長,差異有統計學意義(P<0.05),表明實驗組學習能力明顯受損。見表2。

表2 兩組不同培養時間平均潛伏時間及穿越平臺次數比較

2.2.2空間探索實驗結果 與對照組比較,實驗組2、4、6 w穿越平臺次數減少,差異有統計學意義(P<0.05)。且隨著實驗組飼養時間延長,其穿越平臺次數逐漸減少,差異有統計學意義(P<0.05),提示實驗組出現明顯的空間定位記憶缺陷。見表2。

2.3各組海馬HE染色結果 實驗組2、4、6 w神經元變性壞死計數與對照組同期比較明顯增加(均P<0.05)。見表3。對照組各時間點海馬CA1區神經元細胞形態規則,大小形狀正常,細胞核呈圓形或橢圓形,細胞輪廓及邊界清晰,細胞排列致密、整齊,核仁明顯且核質分明,有少量異染色質。對照組各期海馬CA1區部分神經元細胞出現核固縮,細胞排列松散、紊亂,邊界不清,細胞周圍間隙增寬,形態不規則。隨著OSAS時間延長,神經元數量減少,細胞變形、壞死細胞逐漸增多,細胞核模糊。亦可見細胞空泡化,胞質成分不明顯。見圖1。

圖1 HE染色觀察兩組不同培養時間海馬CA1區組織病理學(×40)

表3 各組不同培養時間海馬CA1區神經元變性壞死計數及IBA-1表達比較

2.4免疫組化觀察兩組海馬CA1區小膠質細胞標記物IBA-1表達 圖2可知,對照組2、4、6 w可見靜息期小膠質細胞,表現為:數量少,染色淺,細胞體小而長,可見有伸向各個方向的呈分枝狀細長的突起。實驗組2、4、6 w,可見激活后的小膠質細胞,表現為細胞突起增粗,細胞深染,細胞體變大、膨脹。實驗組2、4、6 w IBA-1的IOD值與對照組同期比較明顯增加(P均<0.05)。見表3。

圖2 兩組培養不同時間海馬CA1區IBA-1表達[×200;小框所指為箭頭處局部放大的IBA-1小膠質細胞(×400)]

2.5海馬神經損傷與行為學、小膠質細胞活化的相關性 海馬CA1區神經元變性壞死細胞數與Morris水迷宮實驗第5天逃避潛伏期時間呈顯著正相關(r=0.848,P<0.05),與Morris水迷宮實驗第5天空間探索數據呈顯著負相關(r=-0.820,P<0.05)。海馬神經損傷與小膠質細胞活化:海馬CA1區神經元變性壞死細胞數與海馬CA1區IBA-1免疫組化染色結果呈顯著正相關(r=0.774,P<0.05)。

3 討 論

CIH是OSAS的主要病理特征,而間歇性缺氧和睡眠碎片化可以影響成人海馬神經元,患有OSAS并發癥的老年患者可能會加速腦萎縮、認知能力下降及癡呆的發生。有證據提示,OSAS動物模型中的CIH與空間學習受損有關,這與皮層和海馬CA1區的細胞凋亡增加及神經細胞損傷有關〔11～13〕。OSAS致認知障礙的機制包括CIH、氧化應激、睡眠結構紊亂及神經炎癥等,其中神經炎癥的變化,與小膠質細胞密切相關〔9,14〕。已經有動物實驗證實,CIH導致小鼠背側海馬體的輕度神經炎癥,包括早期炎性細胞因子升高、后期小膠質細胞變化及對脂多糖炎癥挑戰的細胞因子反應改變。這些變化可能會導致CIH誘導的認知障礙和病理性腦老化〔15〕。已知在中樞神經系統中,巨噬細胞和小膠質細胞被細胞因子激活并分化為促炎(M1)或抗炎(M2)譜。細胞因子如白細胞介素(IL)-6、IL-5、腫瘤壞死因子(TNF)-α和γ-干擾素(IFN-γ)通常負責激活小膠質細胞進入促炎M1譜以清除病原體和受損組織,并激活凋亡途徑。而IL-4、IL-10和IL-13細胞因子促使小膠質細胞分化為抗炎M2譜以促進細胞存活并抑制炎癥通路。然后激活的小膠質細胞會釋放與其特征一致的細胞因子,以進一步誘導額外的免疫反應。在穩態條件下,這些激活的細胞因子被平衡以維持細胞健康。然而,這些互補譜的失調可能由炎癥系統的慢性激活引起〔16,17〕,這些可通過后續實驗研究進一步探索。目前,對結構神經元損傷的機制及小膠質細胞在OSAS暴露于CIH期間所起的潛在作用知之甚少。CIH引發了諸如海馬細胞凋亡和學習缺陷等病理。根據大量嚙齒動物模型累積證據證實,CIH確實會誘導大腦中的異位損傷模式,特別是影響皮質、皮質下和海馬區域,最終導致神經元凋亡和小膠質細胞激活〔18〕。氧化應激和神經炎癥對小膠質細胞具有負面機制影響,導致其凋亡。受損的小膠質細胞會釋放大量促炎細胞因子,進一步促進炎癥的級聯反應。一般來說,炎癥的適度激活有利于神經保護,但過度時會導致神經毒性。因此,保護小膠質細胞免受炎癥誘導的細胞凋亡是緩解神經炎癥的一種策略〔19〕。近年來,越來越多的研究表明,線粒體自噬是一種內在的抗炎機制,可啟動功能失調的線粒體的清除并限制過度的炎性細胞因子產生,最終抑制神經炎癥〔20〕。已有研究證實,通過使用抗氧化及抗炎類藥物,如芝麻酚等可降低海馬體神經炎癥細胞因子的表達,減輕CIH大鼠認知障礙〔21,22〕。

綜上,OSAS模型大鼠致認知障礙可以導致海馬CA1區神經細胞病理損害,同時引起小膠質細胞的激活,可能與神經炎癥有關,表明神經炎癥相關通路可能參與OSAS致認知障礙的過程中,抗神經炎癥可能成為OSAS海馬損傷的治療方法之一。