基于Sirt1通路研究白茅根提取物對心力衰竭大鼠心肌纖維化的干預作用

柳麗 梅葵 柳建

(六盤水市人民醫院 1心血管內科,貴州 六盤水 553000;2內分泌科;3重癥醫學科)

心力衰竭指在多種致病因素作用下,心臟泵功能發生異常變化,導致心輸出量絕對減少或相對不足,不能滿足機體組織細胞代謝需要,患者有明顯臨床癥狀和體征的病理過程〔1～3〕。主要表現為呼吸困難、肺水腫、心源性休克和血流動力學障礙等。炎癥反應、心肌組織心肌纖維化是導致心功能損傷,引起心力衰竭的主要原因〔4,5〕。白茅根具有抗炎、益氣活血、阻止膠原蛋白合成等功能,能夠減輕患者心力衰竭指標及炎癥水平等,但作用機制尚不明確。心肌纖維化包括間質纖維化和心肌間質膠原沉積,屬于多種不同的心臟疾病發展到一定時期時共同病理改變〔6,7〕。本研究分析白茅根取物對心力衰竭大鼠心肌纖維化的干預作用及對Sirt1信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取45只SD健康雄性大鼠(河南省疾病預防控制中心,使用許可證號:SYXK(豫)2017-0009),8～9周齡;體質量185～220 g,平均(197.5±10.0)g。在溫度(22.0±2.6) ℃、濕度50%～55%環境中喂養1 w,正常飲水,規律光照12 h/d。主要試劑:取白茅根100 g,加水浸泡1 h,煮沸后煎30 min,過濾殘渣再加水煎30 min后過濾合并兩次過濾,經2 000 r/min,離心15 min。取上清液,濃縮至100 ml放置4 ℃冰箱保存。兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6購自上海酶聯生物研究所;兔抗人細胞沉默調節蛋白(Sirt)1、叉頭轉錄因子(Fox)o1小鼠抗大鼠購自北京百奧萊科技有限公司;一抗兔抗鼠Ac-Foxo1購自艾美捷科技有限公司。

1.2建模及分組干預 正常組選取15只大鼠,其余30只建立心力衰竭大鼠心肌纖維化模型。模型組采用腹主動脈縮窄法建立舒張性心力衰竭(DHF)模型,用7號針頭平行置于腹主動脈上,絲線扎緊后抽出針頭,術后腹主動脈直徑由1.0～1.2 mm減少至0.7 mm左右;正常組僅游離腹主動脈但不縮窄,其他操作與手術組相同。術后8 w,兩組分別按完全隨機分組法抽取3只大鼠通過超聲心動圖及心導管檢測心臟舒張功能確立造模成功。建模過程中死亡2只,將剩余28只成模大鼠隨機分為模型組和白茅根組各14只。正常組給予溫生理鹽水灌胃處理,10 ml/(kg·d);模型組和正常組接受等體積生理鹽水灌胃處理;白茅根組給予白茅根湯處理10 ml/(kg·d),持續喂養8 w。

1.3HE 染色觀察心肌組織形態 采集靜脈血,2 000 r/min室溫離心 10 min,取上清液置于-20 ℃冰箱中保存待用。立即處死大鼠,取心肌組織,部分置于 4%多聚甲醛中固定,部分置于-80 ℃冰箱中保存待用。取出多聚甲醛中固定的心肌組織,制備常規石蠟切片后每組取部分切片經脫蠟、水化處理后,蘇木素染色,鹽酸乙醇分化至返藍,乙醇伊紅復染后脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡拍照。

1.4炎性因子水平檢測 采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6及心肌組織中纖維連接蛋白(FN)水平,取包被液適當0.1 ml漢克平衡鹽溶液(HBS)-lg稀釋溶液加入含有聚苯乙烯反應板。加蓋,放入4 ℃冰箱中,24 h,次日使用洗滌液洗滌,重復3次,甩干。將0.1 ml不同倍數血清加入每個孔中,同時將陽性和陰性對照血清加入,移去液體。洗滌,重復3次,甩干。再將每孔內加入0.1 ml辣根過氧化物酶(HRP)-抗體HBS-lgG,稀釋,放置43 ℃溫箱中60 min,移去液體,使用洗滌液洗滌,3次,甩干;將各個孔中注入0.1 ml底物液,避光放置20 min。再將各孔中加入0.05 ml 2 mol/L H2SO4終止反應。

1.5心肌纖維化指標檢測 使用醫學圖像分析系統測量心肌纖維化相關指標,包括心肌血管周圍膠原與管腔面積比例(PVCA)、左心室重量指數(LVMI)、心肌膠原體積比例(CVF)等指標,隨機取每張心肌切片4個視野,取其平均值。

1.6心功能指標和血流動力學 采用無創血壓測量系統讀取左室舒張末期壓(LVEDP)和左心室收縮壓(LVSP)。

1.7Western印跡測定Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表達量 檢測心肌組織Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1蛋白表達水平,冰箱中取心肌組織,磨碎,蛋白提取試劑盒提取總蛋白,凝膠電泳分離蛋白質,轉膜;5%脫脂奶粉恒溫封閉2 h;對應加入一抗Sirt1(1∶10 000)、Foxo1(1∶500)、Ac-Foxo1(1∶250)、人磷酸苷油酸脫氫酶(GADPH,1∶10 000),4 ℃孵育過夜;加入對應二抗,室溫孵育2 h。蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1心肌組織HE染色 正常組心肌細胞排列整齊,肌原纖維完整,細胞核和細胞結構完整;模型組心肌纖維化,細胞形態不完整,心肌細胞增生性炎癥浸潤現象明顯;白茅根組細胞排列較整齊、炎癥現象降低。見圖1。

圖1 3組心肌組織(HE染色,×400)

2.2各組血清炎性因子水平比較 與正常組相比,模型組和白茅根組血清TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,白茅根組血清TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清炎性因子及心肌纖維化指標比較

2.3各組心肌纖維化指標水平比較 與正常組相比,模型組和白茅根組LVMI、PVCA、CVF指標水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,白茅根組上述指標水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組心功能指標和血流動力學的比較 與正常組相比,模型組LVEDP水平明顯升高,LVSP水平明顯下降(P<0.05);與模型組相比,白茅根組LVEDP水平明顯降低,LVSP水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.5各組心肌組織Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1蛋白表達水平比較 與正常組相比,模型組和白茅根組Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表達明顯升高,Sirt1蛋白表達明顯降低(P<0.05);與模型組相比,白茅根組上述指標差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組心功能指標水平、心肌組織Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表達量比較

圖2 各組心肌組織Sirt1通路蛋白表達

3 討 論

心力衰竭是由于心排血量不足或心臟泵血功能受損功能發生障礙,導致心臟不能搏出同靜脈回流及機體組織代謝所需的血液供應。心肌細胞減少是導致心肌功能障礙的關鍵因素〔8,9〕。因冠狀動脈血管壁周圍纖維增生和管壁增厚使冠脈循環儲備和供血降低,進而促使心肌細胞死亡和纖維化,是難治性心力衰竭的病理基礎,是心血管疾病的主要死亡原因。

心力衰竭與中醫癥候怔忡、水腫、心悸、痰飲、心痹等疾病相似,孫思邈《備急千金藥房·脾臟脈論第一》中指出“心水者,身腫而少氣,不得臥,煩而躁,其陰大腫,反瘦”,治療上以益氣溫陽、益氣養陰、益氣活血、活血利水、活血化瘀為主。中醫認為,白茅根性寒、味甘,可入肺經、胃經和膀胱經,具有涼血止血、清熱利尿的作用。《本草綱目》中記載,白茅根可“止吐衄諸血、傷寒噦逆、肺熱喘急、水腫黃疸、解酒毒”。研究發現,白茅根提取物具有鎮痛抗炎、增強免疫功能、抑制毛細血管通透性增加、抗心肌缺血、降血壓、可降低全血黏稠度、降低血細胞聚集性、改善血流變性從而起到抗血栓效果〔10,11〕。本研究結果表明,白茅根提取物能夠調節心肌射血受損,對心肌組織起到保護的作用。

使用白茅根提取物治療心力衰竭大鼠心肌纖維化,LVMI、PVCA、CVF指標水平較低,血清炎癥TNF-α、IL-6水平下降,LVMI、PVCA、CVF水平升高,表現為基質沉積、纖維化現象越嚴重〔12,13〕。研究發現,心肌纖維化伴隨炎癥水平升高,IL-6、TNF-α作為炎癥因子參與心肌細胞壞死過程,TNF-α可誘導IL-6釋放,IL-6能加強組織細胞對TNF-α的敏感性〔14,15〕;IL-6可影響心肌收縮力,TNF-α可介導心肌重構和心肌收縮力。本研究提示,白茅根提取可減緩心肌纖維化、炎癥損傷體征,對心肌起到保護作用。

Sirt1與多種信號傳導通路中的蛋白和轉錄因子等蛋白相互作用參與神經保護、細胞衰老凋亡、糖脂代謝、炎癥氧化應激反應等過程,發揮其對基因的調控功能和心血管的保護〔16,17〕。Sirt1水平降低使心肌細胞保護作用減弱是導致心功能病變的主要原因。Sirt1激活可抑制降低炎癥因子IL-6、TNF-α水平,實現對膿毒癥誘導的小鼠腦損傷。Foxo1是Foxo亞家族中發現最早的轉錄因子,在機體細胞增殖、凋亡、抵抗氧化應激等方面發揮重要作用〔18,19〕。Sirt1通過調節Foxo1蛋白去乙?；饔?去乙?；?轉錄活性減弱,進而參與疾病的發生使Foxo1與DNA結合促進其轉錄活性。Foxo1的水平能夠調控與骨骼肌萎縮相關蛋白,從而加重慢性心力衰竭導致的骨骼肌萎縮現象。研究指出,Foxo1介導途徑能夠改善高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝疾病中以膠原蛋白沉積和纖維化蛋白表達形式出現的肝纖維化〔20,21〕。