白皮杉醇對糖尿病腎病腎小管間質纖維化、腎小管凋亡及FoxO1表達的影響

崔璨 宋瑋 田華 侯文雁

(商丘醫學高等專科學校 1診斷教研室,河南 商丘 476000;2生化教研室)

2000～2019年糖尿病相關死亡率增加70%〔1,2〕。長期患有糖尿病的患者往往出現代謝和實驗室生化指標的改變,引發先天性免疫反應,導致血管并發癥。糖尿病腎病(DN)是糖尿病的嚴重并發癥之一,已成為全球最常見的導致終末期腎病的原發性疾病〔3〕。DN是由長期糖尿病相關的代謝和血流動力學紊亂引起的〔4,5〕,既往研究證實了腎小管損傷在DN進展中的重要性,隨著腎小管間質纖維化的發展,最終導致終末期腎病、腎衰竭、透析或腎臟移植等。鑒于腎小管損傷在DN發病機制中的重要性,臨床亟待尋找新型藥物以減輕腎小管損傷并延緩DN的發展。白皮杉醇(Pic)是一種主要存在于種子、葡萄酒和水果中的天然二苯乙烯〔6～8〕。據報道,Pic對多種疾病具有保護作用,如代謝性心肌病、缺血性心肌病等,并具有抗癌功能〔9～11〕。研究表明,由于Pic抗炎、抗氧化特性,其在調節多種生理過程中起關鍵作用〔12,13〕。Pic通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)途徑抑制氧化應激,減輕年齡相關性黃斑變性小鼠的黃斑視網膜色素上皮細胞變性〔14〕;調節核因子(NF)E2相關因子(Nrf)2/血紅素氧化酶(HO)-1和NF-κB通路,減輕糖尿病心肌病中的炎癥和氧化應激損傷〔12〕。此外,Pic還可通過激活沉默調節蛋白(Sirt)1/叉頭框蛋白(Fox)O1信號通路,在腦缺血/再灌注誘導的凋亡和氧化應激中發揮保護性作用〔15〕。目前關于Pic對DN腎小管損傷影響的相關研究較少,且具體作用機制尚不明確。本研究旨在通過探討Pic對DN腎小管間質纖維化、腎小管凋亡的影響,研究其可能的作用通路,為臨床應用Pic治療DN提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 健康8周齡,24 g左右體質量的C57BL/6雄性小鼠,共40只,購自河南省實驗動物中心,將小鼠飼養于相對恒溫、恒濕的環境中,自由進食和飲水,適應性飼養1 w。人腎小管上皮細胞株HK-2購自上海富衡生物科技有限公司。Pic購自樂美天醫藥。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma-Aldrich公司。D-葡萄糖購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗(100×)、磷酸鹽緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA)-胰蛋白酶消化液、DMEM/F12培養基均購自美國Gibco公司。Sirt1(ab110304)、FoxO1(ab179450)、磷酸化FoxO1(p-FoxO1,ab47326)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3(ab184787)、裂解(Cleaved) Caspase-3(ab32042)、(Bax,ab32503)、E-cadherin(ab231303)、α-平滑肌動蛋白(SMA,ab5694)及β-肌動蛋白(actin,ab8226)抗體購于英國abcam公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)強裂解液、4%多聚甲醛、封閉液、一抗和二抗稀釋液、二抗均購自碧云天生物科技有限公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司。

1.2動物模型的制作和分組 將40只C57BL/6小鼠隨機分為5組,分別為正常對照(Control)組、模型(Model)組、Pic低劑量(Low-Pic)組、Pic中劑量(Mid-Pic)組及Pic高劑量(High-Pic)組各8只,除Control組外,其他組進行高糖高脂飲食,并配合STZ腹腔注射誘導構建DN小鼠模型,小鼠尾靜脈空腹血糖>16.65 mmol/L、24 h尿蛋白定量≥20 mg提示DN模型成功建立。Low-Pic、Mid-Pic及High-Pic組,DN造模成功后,分別給予Pic 10、20及40 mg/kg灌胃2 w,Control組及Model組給予等量生理鹽水灌胃處理。在相應處理結束后,小鼠眼眶采血,室溫、5 000 r/min離心20 min留取血清保存于-80 ℃冰箱待用,頸椎脫臼法處死小鼠,解剖留取雙側腎臟組織,使用磷酸鹽緩沖液清洗后,保存備用。本研究所涉及動物的所有實驗方法及操作已經醫院倫理審查委員會批準。

1.3細胞培養及分組 使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基,在恒溫、恒濕、含5%CO2的細胞培養箱中對HK-2細胞進行培養。將HK-2細胞隨機分為5組,分別為Control組、Model組、Low-Pic組、Mid-Pic組及High-Pic組。除Control組外,使用30 mmol/L D-葡萄糖對其他組處理72 h后,對Low-Pic組、Mid-Pic組及High-Pic組分別進行Pic 10、20及40 μmol/L處理24 h〔16〕。

1.4檢測小鼠腎功能及血糖指標 采用全自動生化分析儀檢測小鼠空腹血糖、血清肌酐、尿素氮及24 h尿總蛋白。

1.5Western印跡法測定細胞蛋白表達 使用RIPA強裂解液冰上裂解細胞30 min后,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,留取蛋白上清,使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。制備10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠,每孔上樣15 μg 蛋白樣本進行電泳分離,并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室溫、25 r/min封閉PVDF膜1 h后分別加入對應一抗Sirt1(1∶2 000)、FoxO1(1∶2 000)、p-FoxO1(1∶1 000)、Caspase-3(1∶2 000)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、E-cadherin(1∶2 000)、α-SMA(1∶2 000)及β-actin(1∶3 000),4 ℃、25 r/min孵育過夜,次日使用對應二抗在室溫條件下孵育1 h后使用增強型化學發光(ECL)顯影液,在Bio-Rad熒光成像系統中進行蛋白條帶發光成像,并用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組空腹血糖及腎功能指標比較 與Model組相比,Low-Pic、Mid-Pic、High-Pic組腎損傷指標、空腹血糖顯著降低,且呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 各組空腹血糖及腎功能指標比較

2.2各組纖維化及凋亡蛋白表達水平比較 與Control組相比,Model組E-cadherin蛋白顯著減少,而α-SMA、Cleaved Caspase-3及Bax蛋白水平顯著增加,Low-Pic、Mid-Pic、High-Pic組可顯著逆轉上述變化,且Pic呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 各組纖維化、凋亡蛋白、Sirt1、p-FoxO1表達水平比較

2.3各組Sirt1、p-FoxO1表達水平比較 與Control組相比,Model組Sirt1及p-FoxO1蛋白顯著減少,Low-Pic、Mid-Pic、High-Pic可顯著逆轉上述變化且呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

3 討 論

Pic是白藜蘆醇羥基化衍生物及代謝物,廣泛存在于植物中。Pic具有抗炎、抗氧化應激等作用〔12,13,17〕。張云霞等〔18〕發現PIC可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活,抑制炎癥反應及氧化應激反應的發生,從而減輕DN引起的腎小球內皮損傷。

本研究中Pic逆轉作用呈濃度依賴性,提示高劑量Pic治療有望減輕DN情況下腎小管上皮細胞損傷。Sirt1是一種蛋白質脫乙酰酶,是細胞能量代謝和衰老的重要調節劑〔19〕。有研究證實,Sirt1可抑制腎損傷發生腎纖維化〔20〕。FoxO1由Sirt1調節,并在DN的抗氧化應激中發揮重要作用〔21〕。本研究提示Pic發揮保護性作用可能是通過調節Sirt1/FoxO1加以實現。