基于Nrf2/ARE信號通路探討抑制miR-27b對HICH大鼠模型神經細胞凋亡和炎癥因子的影響

易宇光 何佳佳 吳俊波

(萍鄉市第二人民醫院,江西 萍鄉 337000)

高血性腦出血(HICH)由于腦底小動脈發生病理性變化,相應動脈血管管壁變薄,彈性變小并產生擴張,當情緒變化劇烈、過度勞累、不良的飲食習慣等引起血壓急劇升高直至腦部血管破裂,導致血栓素A2,組胺,緩激肽釋放,改變腦部血液流量分布〔1〕。核因子-E2相關因子(Nrf)2共分為6個功能區,其中Neh4、Neh5 在轉錄激活劑作用下與抗氧化反應原件(ARE)結合,參與啟動下游基因轉錄的結構域〔2,3〕。Nrf2/ARE信號通路作為一種抗氧化防御性轉導通路,在抗氧化、抗細胞凋亡、神經保護等方面扮演著重要角色〔4〕。miR-27b是 miR-27家族的一個亞型〔5〕,miR-27b具有響應生物體氧化應激反應的功能,并參與Ⅱ型糖尿病、神經膠質瘤、胃癌等多種疾病的發生、發展〔6〕。有研究表明〔7〕,Nrf2是miR-27b直接靶基因,有特定的結合位點,Nrf2和miR-27b均對HICH形成有一定的影響,均與抗細胞凋亡及調控炎癥反應相關。本研究基于Nrf2/ARE信號通路探討抑制miR-27b對HICH大鼠模型神經細胞凋亡和炎癥因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 75只健康雄性無特定病原體大鼠(8～10周齡)購自首都醫科大學實驗動物中心(中國北京),在22～25 ℃的單獨通風籠中飼養。

1.2HICH大鼠模型制備 采用6%水合氯醛 (400 mg/kg)對大鼠腹腔麻醉,沿腹中線切開腹腔暴露雙側腎臟,用銀夾鉗夾雙側腎動脈后縫合腹腔;在高血壓術后60 d,將大鼠俯臥位固定于定位儀上,正中矢狀切開頭皮。顱骨背側鉆孔,微量進樣器進針尾狀核位置,斷尾取血,注入大鼠腦內。

1.3實驗分組 75只雄性HICH大鼠稱重并隨機均分為5組:①空白(SM)組:采用腦出血模型同樣的制備方法,但進針后注射50 μl生理鹽水,大腦右側腦室注射5 μl生理鹽水;②對照(HICH)組:采用腦出血模型同樣的制備方法,并大腦右側腦室注射5 μl生理鹽水;③miR-27b陰性對照(HICH+AR)組:大腦右側腦室注射5 μl miR-27b拮抗劑陰性對照物(20 nmoL/L);④miR-27b抑制(HICH+ATR)組:5 μl miR-27b拮抗劑(20 nmoL/L)注入大鼠右側腦室;⑤miR-27b陽性對照(HICH+TBHQ)組:大鼠右側腦室注射5 μl特丁基對苯二酚(TBHQ,50 mg/L,Nrf2激動劑)。所有大鼠都被正常喂養,隨意飲水,交替12 h的明/暗周期。

1.4熒光素酶報告基因分析 含有miR-27b結合位點的野生型(WT)Nrf 2的3′-UTR和突變型(MUT)Nrf2的3′-UTR被擴增并插入pmirGLO載體。WT和MUT的正確熒光素酶報告質粒分別與miR-27b agomir共轉染到HEK-293T細胞中,48 h收集細胞,96孔細胞培養板換成新制備的培養基和熒光素酶底物,光度計測量每個孔中的熒光素酶活性。加終止緩沖液渦旋振蕩10 min后,測量每個孔中的熒光素酶活性。

1.5qRT-PCR試驗 采用Trizol法提取HICH組紋狀體腦組織總RNA進行逆轉錄。分別在建模后的第6 h、12 h、24 h、48 h和72 h,采用qRT-PCR檢測HICH組和SM組miR-27b及Nrf2 mRNA水平,目的基因引物序列如下:miR-27b上游引物5′-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3′、下游5′-CGCAGCTACTCCAAGAATCCG-3′,Nrf2上游引物5′-TTTGT-AGATGACCATGAGTCGC-3′、下游5′-GCACATCTCA-GTGATCTCACCT-3′;GAPDH上游引物5′-CTCCG-ATCTTACGAACA-3′,下游5′-AATGCTAGACGCACTTGCGT-3′。用 cDNA模板對相關基因分別進行PCR擴增,miR-27b的mRNA 3′-5′端引物為試劑盒常用引物。采用2-ΔΔCt表示mRNA相對表達。

1.6Western印跡試驗 取各組大鼠紋狀體腦組織,加入RIPA細胞裂解液,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白,聚偏氟乙烯(PVDF)轉膜,加一抗〔B細胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、GAPDH,24 h〕,再加二抗(Bcl-2、Bax、GAPDH,2 h)。TBST洗膜后顯影成像,蛋白表達相對定量計算。

1.7酶聯免疫吸附試驗 分別從5組收集取大鼠紋狀體腦組織制備10%組織勻漿,試劑盒檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-1β的水平。將40 μl組織勻漿加入到孔中,并在37 ℃孵育60 min,洗滌顯影。在37 ℃下再溫育10 min后,使用消除劑終止反應,測定每支試管中OD值(450 nm)。組織勻漿在4 ℃下離心5 min(3 000 r/min),制備細胞懸浮液,計算細胞總數,進行賴特染色。

1.8噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力 取各組細胞,接種至96孔板,于溫箱培養。加MTT溶液孵育4 h,加150 μl二甲基亞砜(DMSO),檢測波長為OD=490 nm處的吸光度,計算細胞活力。

1.9流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期 收集各組細胞進行胰酶消化,離心后去掉上清,PBS洗2次,吸盡上清液加預冷乙醇溶液振蕩過夜。PBS洗1次,碘化丙啶染色20 min,儀器檢測細胞周期情況。細胞凋亡實驗操作前期步驟同上,取細胞離心并固定,按說明書加入染色劑10 ml,置于4 ℃冰箱中孵育30 min,儀器測定結果并分析。

1.10統計學方法 采用SPAA21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1熒光素酶報告結果 研究通過靶向預測程序證實了Nrf2的3′-UTR和miR-27b序列之間存在特異性結合區。miR-27b和Nrf2之間的靶向關系通過熒光素酶報告基因分析來驗證。見圖1。miR-27b組WT3′-UTR熒光素酶活性被顯著抑制(P< 0.05),而MUT3′-UTR的熒光素酶活性沒有表現出類似的效果(P>0.05)。見表1。

表1 熒光素酶報告結果

圖1 熒光素酶報告結果

2.2qRT-PCR檢測結果 HICH大鼠miR-27b和Nrf2 mRNA表達變化,與SM組相比,在HICH后6 h開始miR-27b表達量顯著下降(P<0.05),24 h miR-27表達達到最低水平;Nrf2 mRNA表達量在HICH后6 h開始顯著上升(P<0.05),在24 h達到最高水平(P<0.05)。見表2。

表2 miR-27b及Nrf2 mRNA相對表達量比較

2.3酶聯免疫吸附試驗結果 與SM組相比,HICH+AR組、HICH組TNF-α、IL-1β及IL-6顯著升高,HICH+ATR組、HICH+TBHQ組TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯降低(均P<0.05)。見表3。

表3 各組Bcl-2和Bax蛋白表達、IL-β、IL-6、TNF-α、細胞活力及凋亡比較

2.4MTT法檢測結果 與SM組比較,HICH組和HICH+AR組可以顯著降低神經細胞活力,而HICH+TBHQ組和HICH+ATR組則會明顯促進細胞增殖(均P<0.05)。見表3。

2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 與SM組比較,HICH組和HICH+AR組細胞凋亡率顯著增加,而HICH+TBHQ組和HICH+ATR組凋亡率顯著下降(均P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 流式細胞分析法檢測各組細胞凋亡

2.6Western印跡檢測結果 與SM組相比,HICH+ATR組、HICH+TBHQ組Bax蛋白表達顯著降低,Bcl-2蛋白顯著升高,HICH+AR組、HICH組Bax蛋白表達顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。見表3、圖3。

1～5:HICH+AR組、HICH+ATR組、HICH+TBHQ組、SM組、HICH組

3 討 論

近些年,HICH發病率逐年升高,外科手術方法對患者身體預后效果差,容易復發,現有的治療藥物如他汀類藥物,內皮素受體拮抗劑等不良反應大,療效差〔8〕。Nrf2/ARE信號通路參與HICH疾病發生,尋找到調控此種信號通路的基因可作為開發新藥物的靶點。miR-27b可直接調控Nrf2基因,且與神經細胞凋亡相關。

HICH發病后產生繼發性損害腦水腫,血腫分解導致血細胞分解產生神經毒性物質,使得炎癥細胞在病灶處聚集,產生大量炎癥因子,造成神經細胞損害和凋亡〔9〕。HICH發病區域多位于尾狀核、殼核和丘腦,故實驗所用腦組織材于尾狀核。HICH最嚴重的的病理反應是神經損害及炎癥反應,對兩種指標即神經細胞凋亡情況及炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平進行了測定。Nrf2/ARE信號通路參與炎癥反應的發生、腫瘤的形成、衰老及細胞凋亡等多種生理疾病發生機制〔10〕,其中與HICH的形成密切相關的作用是抑制神經細胞的凋亡以及抑制炎癥因子的產生〔11,12〕。熒光素酶報告基因分析確定Nrf2是為miR-27b的直接靶基因〔13〕,靶向預測程序結果顯示兩者有特定的結合位點,熒光素酶活性報告與qRT-PCR檢測顯示miR-27b可直接抑制Nrf2的表達,從而阻礙Nrf2/ARE信號通路及其下游相關基因的表達。有研究發現〔14〕,紫檀芪可以通過激活 Nrf2 來上調Bcl-2,下調Bax,抑制胰腺 β 細胞的凋亡。為驗證抑制miR-27b對神經細胞凋亡的影響,研究測定了各組大鼠與凋亡相關的調控基因Bax和Bcl-2 基因,miR-27b抑制組相比對照組Bcl-2表達顯著上調,Bax蛋白含量明顯降低,miR-27b抑制組相比對照組神經細胞活力相比明顯升高,細胞凋亡數顯著下降〔15〕。抑制miR-27b可激活Nrf2/ARE信號通路,使得Bcl-2 蛋白過量表達并結合Bax,增強神經細胞活力,減少神經細胞凋亡〔16〕。有研究〔17〕顯示,對照組抑制Nrf2的表達,發現miR-27b抑制組的HICH大鼠與Nrf2促進劑的大鼠三者驗證因子表達水平遠小于HICH組,說明抑制miR-27b的表達,增加Nrf2的表達激活Nrf2/ARE信號通路,抑制巨噬細胞活性,減少炎細胞浸潤現象,從而減少炎癥因子的含量起到抗炎的作用。

近年Nrf2/ARE信號通路受到廣泛關注,未有研究發現HICH疾病的神經細胞凋亡及炎癥反應可通過miR-27b調控Nrf2/ARE信號通路來控制,本研究具有首創性。根據此次研究可以為研發治療HICH疾病的相關藥物提供新的思路和依據。但研究仍有局限性,如HICH大鼠模型的建立通過向腦部注射自體血液模擬腦出血,達到簡單模擬與真實情況相差較大,此外炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6都是NF-κB的表達產物,可進一步研究NF-κB與Nrf2/ARE信號通路的關聯。

綜上,通過抑制miR-27b的表達,增加Nrf2的表達使得Bcl-2 蛋白過表達并結合Bax蛋白實現了抑制HICH大鼠神經細胞的凋亡及減少HICH大鼠炎癥因子含量從而抑制炎癥反應發生。