醒腦灌腸液對心搏驟停心肺復(fù)蘇后大鼠海馬區(qū)Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響

葉倩雅 李華 周生花 任冬冬 李宗尚 郭燕可

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450002;2河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院))

心搏驟停(CA)是全球范圍內(nèi)高致死率的疾病之一〔1〕。據(jù)美國2020年CA統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,院外CA(OHCA)發(fā)生率每年占總?cè)丝诘?.04%～0.13%,經(jīng)積極心肺復(fù)蘇(CPR)后自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)而入院的患者中,只有10.4%的患者可存活至出院,腦功能恢復(fù)良好的僅占8.2%〔2〕。CPR雖然是有效的救治手段,但仍面臨腦功能恢復(fù)不全的難題。目前,針對該問題的西藥療效參差,僅亞低溫治療有一定效果,然而尚未出現(xiàn)成熟治療方案。臨床上中醫(yī)用于神經(jīng)保護(hù)的藥物療效較為確切,其中醒腦灌腸液作用明顯〔3〕。研究表明,醒腦灌腸液的抗炎作用顯著,大多僅著眼于腦局部缺血、缺氧等相關(guān)的疾病模型研究,如腦出血模型等〔4〕,而關(guān)于醒腦灌腸液能否通過調(diào)節(jié)凋亡通路蛋白起全腦保護(hù)作用的機(jī)制尚未見報道。本研究建立CA/CPR后大鼠全腦神經(jīng)元損傷模型,探索醒腦灌腸液對于調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的影響。

1 材料與方法

1.1試驗藥物 實驗大鼠用醒腦灌腸液,處方為大黃15 g、水蛭10 g、石菖蒲12 g、冰片2 g,每劑含藥量39 g,購于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)院中藥房。將醒腦灌腸液方劑藥物中的大黃、水蛭、石菖蒲按照比例加 15 倍量水煎煮兩次,每次1 h,濾過后藥液合并,減壓濃縮。將冰片細(xì)研磨,過篩,篩孔尺寸小于1 mm,加至前述藥液,融化后冷藏,使用時水浴加熱至 25 ℃。安宮牛黃丸:去除塑料球殼,加適量蒸餾水恒溫100 ℃水浴加熱,攪拌融化,冷藏備用。安宮牛黃丸(生產(chǎn)批號:20017004)購于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。以上藥液按照等效劑量換算并濃縮成 1 g/ml 的濃縮液。

1.2動物 SD雄性大鼠24只,SPF級,體質(zhì)量(260.0±37.7)g,購于鄭州華興實驗動物基地,飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室,溫度維持在24～26 ℃,濕度為30%～40%,飼養(yǎng)條件為大鼠獨(dú)立通氣籠具(IVC),無菌飼料和墊料喂養(yǎng),去離子水供應(yīng),以上由管理員雷震老師負(fù)責(zé)管理。經(jīng)實驗動物倫理審查通過批準(zhǔn)后進(jìn)行實驗(審批號:PZ-HNSZYY-2020-018)。

1.3試劑 Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體(中國成都,正能生物公司,批號250198、380709、381337);GAPDH 抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:00077958、1008047);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:112720201223);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司,批號:IPVH0010);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠試劑盒(中暉赫彩生物公司,批號:BAO223)。

1.4設(shè)備 包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司,JB-P5);病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司,RM2016);脫色搖床(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司,XK-8);光學(xué)顯微鏡(日本尼康,NK20);SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)(型號:Mini-PROTEAN)、蛋白濕轉(zhuǎn)儀(型號:Mini Trans-Blot)、WB成像系統(tǒng)(美國伯樂公司,型號:ChemiDoc XRS+)。

1.5方法

1.5.1實驗?zāi)Ｐ图胺纸M 遵循Utstein〔5〕模式CPR造模方法,使用窒息法建立大鼠模型。制造模型前禁食8 h,正常飲水。大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上,戊巴比妥鈉1 ml/kg 進(jìn)行麻醉。14 G自制動脈套管行氣管插管。連接生物信號采集處理系統(tǒng)實時監(jiān)測心電Ⅱ?qū)?lián),確保心電圖和心率(HR)在基線水平,觀察大鼠HR為300～500次/min〔6〕的納入實驗,若不滿足基線條件則排除實驗。體征穩(wěn)定15 min后,消毒備皮,分離出左股動脈連接壓力換能器,通過壓力傳感系統(tǒng)記錄大鼠動脈血壓(MAP)變化,血壓在80～155 mmHg〔7〕者納入實驗,否則排除;右股靜脈連接24G動脈留置針備用,用于搶救時給藥。頸部皮膚沿正中線切開,鈍性分離出0.5～1.0 cm長氣管,注意分離出氣管旁迷走神經(jīng)以防影響HR。氣管插管端連通小動物呼吸機(jī),通氣氧濃度21%,潮氣量4 ml/kg,頻率為100次/min。保持大鼠平穩(wěn)狀態(tài)5 min后,關(guān)停小動物呼吸機(jī)并用動脈夾夾閉氣管,觀察MAP和HR,判斷CA標(biāo)準(zhǔn)〔8～10〕為:MAP≤20 mmHg;心電圖出現(xiàn)無脈電活動、機(jī)械分離和(或)室顫波或心電活動停止表現(xiàn)。CA 3 min后松開夾閉氣管的動脈夾,進(jìn)行常規(guī)搶救措施,呼吸機(jī)打開行機(jī)械通氣,同時進(jìn)行胸外心臟按壓,要求頻率≥200次/min,按壓深度達(dá)到大鼠胸廓前后徑的1/3以上。同時經(jīng)留置針給予腎上腺素0.02 mg/kg及電除顫或利多卡因1.5 mg/kg除顫等進(jìn)行常規(guī)急救治療。在大鼠ROSC后(即HR≥170次/min且MAP≥60 mmHg)并且能持續(xù) 5 min,則認(rèn)為已復(fù)蘇成功,終止按壓。胸外按壓超過10 min未發(fā)生ROSC者,認(rèn)為復(fù)蘇失敗,終止CPR。為制備模型共準(zhǔn)備大鼠37只,基線均符合標(biāo)準(zhǔn),死亡19只,成功18只,建立CPR模型,可達(dá)到ROSC的成功率為48.64%,各組大鼠若出現(xiàn)死亡則從同批次大鼠選擇并隨機(jī)補(bǔ)充。造模成功后,隨機(jī)分為模型(CPR)組、醒腦灌腸液(XNGC)組、安宮牛黃丸(AGNH)組各6只。另隨機(jī)取6只大鼠為假手術(shù)(Sham)組。各組大鼠生命體征穩(wěn)定后20 min,Sham組和CPR組給予常規(guī)西醫(yī)急救治療并予生理鹽水灌腸,其余組除常規(guī)治療外,按照相應(yīng)等效劑量為XNGC和AGNH兩組大鼠給藥。

1.5.2實驗給藥和取材 CPR組、XNGC組和AGNH組均進(jìn)行CPR模型制備,而Sham組不進(jìn)行氣管夾閉、CPR操作,余處理同前3組。實驗大鼠用醒腦灌腸液,等效折算系數(shù)為0.018,故XNGC組給藥3.60 g/kg。安宮牛黃丸患者使用劑量為3 g,因此AGNH組大鼠等效給藥0.27 g/kg。在ROSC后0、24、48 h分別給藥,Sham組和CPR組給予生理鹽水灌腸,XNGC組和AGNH組分別根據(jù)大鼠體質(zhì)量換算給藥劑量并進(jìn)行灌腸給藥。將ROSC模型成功時記為0 h,在72 h時對大鼠進(jìn)行空氣栓塞處死,并斷頭取腦,分別置于液氮和4%多聚甲醛中備用于后續(xù)實驗。

1.5.3神經(jīng)功能缺陷評分(NDS)〔11〕在CPR后2、24、48 h時分別對大鼠進(jìn)行NDS,評分范圍為0%～100%,正常大鼠NDS為0%,腦死亡大鼠NDS為100%。從5個不同維度進(jìn)行神經(jīng)功能評價:意識和呼吸、腦神經(jīng)功能、運(yùn)動功能、感覺功能和平衡協(xié)調(diào)功能(包括平衡木行走)等。

1.5.4病理切片染色 取大鼠腦組織,并將組織浸泡于4%多聚甲醛常溫下固定24 h以上,組織包埋石蠟修塊后,以5 μm連續(xù)切片,固定在載玻片后用梯度濃度的乙醇脫水,入蘇木素染液染8～10 min,用分化液分化、返藍(lán)液返藍(lán),梯度酒精脫水后,伊紅染液中復(fù)染8～10 min。最后,將切片脫水封片并在顯微鏡下觀察拍照。

本研究在文獻(xiàn)查閱與問卷調(diào)查的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)問題，提出研究構(gòu)思，然后根據(jù)文獻(xiàn)查閱及問卷分析，對小學(xué)生數(shù)學(xué)基本活動經(jīng)驗積累策略進(jìn)行研究。除了采用文獻(xiàn)法，主要有以下幾種方法。

1.5.5免疫組化(IHC) 取大鼠腦組織,并浸泡于4%多聚甲醛常溫下固定24 h以上,常規(guī)包埋修塊后,以5 μm連續(xù)切片后進(jìn)行脫蠟水化,高溫煮沸進(jìn)行抗原修復(fù),加入一抗(Bcl-2為1∶200;Bax為1∶200;Caspase-3為1∶500,均為中國,正能生物公司提供)50 μl,4 ℃冰箱孵育過夜,滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG 50 μl,室溫放置15 min,加鏈霉親和素-過氧化物酶溶液,同條件孵育15 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-H2O2顯色、蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水固定。顯微鏡下觀察,并用平均光密度值(IOD/Area)累計各切片陽性區(qū)域細(xì)胞表達(dá)百分比,并進(jìn)行組間統(tǒng)計學(xué)對比。

1.5.6Western印跡 取大鼠腦組織分離出海馬區(qū)并馬上置于液氮保存,取材后放置-80 ℃冰箱凍存。取海馬區(qū)的腦組織各300 mg,加入鋼珠和裂解液(每300 mg加300 μl裂解液)后置于電動勻漿機(jī)快速勻漿,常規(guī)冰下裂解組織,提取蛋白,并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取12%的SDS-PAGE處理10 μg蛋白,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,加一抗(Bcl-2為1∶500;Bax為1∶1 000;Caspase-3為1∶1 000;均為中國,正能生物公司提供)4 ℃過夜。TBST洗滌3次,10 min/次,膜上加二抗(兔/鼠抗鼠,1∶2 000稀釋),電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液曝光后凝膠成像儀顯影。實驗重復(fù)3次。Image Lab軟件分析并計算相對灰度值進(jìn)行半定量,對比結(jié)果。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0和GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析、LSD-t檢驗、Kruskal-WallisH檢驗、Log-rank法χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組基線情況比較 各組血壓、HR、體質(zhì)量和呼吸頻率情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組基線資料及CA CPR模型情況對比

2.2各組CA CPR模型情況比較 CPR組、XNGC組和AGNH組CA時長、CPR時長、腎上腺素用量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

2.3各組NDS比較 與Sham組比較,CPR、XNGC、AGNH組2、24、48 h NDS明顯增加(P<0.01);ROSC后2 h時,CPR、XNGC和AGNH組NDS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。24 h時,XNGC組、AGNH組與CPR組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05);48 h時,XNGC組、AGNH組與CPR組比較,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組CPR后2、24、48 h NDS比較

2.4各組病理形態(tài)觀察 與Sham組相比,CPR組海馬區(qū)細(xì)胞明顯核固縮碎裂,且細(xì)胞排列紊亂,有較多細(xì)胞水腫和胞質(zhì)空泡狀。與CPR組相比,XNGC和AGNH組海馬區(qū)細(xì)胞排列較整齊,且胞質(zhì)空泡狀減少,核固縮碎裂情況有所改善,細(xì)胞水腫少見。見圖1。

圖1 各組海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)(HE染色,×400)

圖2 各組海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)(免疫組化染色,×400)

表3 各組Bcl-2、Bax和Caspase-3陽性細(xì)胞平均光密度比值

2.6各組CPR后海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3、蛋白表達(dá) 與Sham組相比,CPR組海馬區(qū)細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào),Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.01)。與CPR組相比,XNGC和AGNH組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01,P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組CPR后海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

表4 各組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)相對灰度值

2.7各組存活率 Sham組存活率為100.0%。與CPR組(33.3%)相比,XNGC組和AGNH組48 h內(nèi)存活率(83.3%、83.3%)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.695,P=0.035)。

3 討 論

醒腦灌腸液為中藥復(fù)方,由大黃、水蛭、石菖蒲、冰片組成,臨床應(yīng)用此方已21年余。大黃扶正攻下,消瘀清熱,明朝時期《本草綱目》記載用于瘟疫陽狂、斑黃譫語〔12〕,現(xiàn)今也用于急危重病〔13〕。石菖蒲具有通腑祛痰、開竅醒神之效〔14〕;水蛭破血通經(jīng)、活血化瘀;冰片開竅清熱、逐瘀醒腦。四藥合用,則能發(fā)揮該方劑的神經(jīng)保護(hù)作用〔15〕。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,本方對腦局部缺血、出血疾病的研究較為成熟。其中大黃通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB通路可以抗凋亡〔16〕等;石菖蒲提取成分能夠通過抑制TNF-α/NF-κB信號進(jìn)而抑制凋亡〔17〕;水蛭提取物在臨床上具有抗腦缺血、改善側(cè)支循環(huán)的功效〔18〕,而水蛭素兼具抗凋亡〔19〕作用;冰片可作用于緊密連接蛋白基因進(jìn)而影響B(tài)ax/Bcl-2復(fù)合物而發(fā)揮抗凋亡作用〔20〕。然而以上研究均著重于此方治療局部腦損傷,對于全腦損傷模型的研究較少。對于CA/CPR后全腦損傷者,有研究證實醒腦灌腸液可使CA/CPR模型大鼠的炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-33/生長刺激表達(dá)基因2蛋白(ST2)表達(dá)下調(diào)〔21〕,從而有力證明本復(fù)方對CA/CPR后大鼠腦損傷具有抗炎功效。隨著研究進(jìn)展,探索凋亡通路在該疾病模型的中提供腦保護(hù)的可能是種延伸和新思路。安宮牛黃丸在CA患者〔22〕及各項動物實驗研究〔23〕中顯示,對于調(diào)節(jié)Bcl-2相關(guān)凋亡通路蛋白有顯著藥效,而CA/CPR后大鼠具有相似的病理生理機(jī)制,如腦缺血再灌注損傷及缺血缺氧性腦病機(jī)制,因此推測安宮牛黃丸在此模型中同樣發(fā)揮抗凋亡作用,選用為陽性對照組藥物。

窒息法行CA大鼠模型建立有很大優(yōu)勢〔24〕。窒息法作為Utstein模式的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),在CA/CPR大鼠模型具有權(quán)威意義。模型制備過程中,總體可達(dá)到ROSC的成功率約50%,其中CA時間是較難把控的關(guān)鍵點(diǎn),而本研究從夾閉氣管到開始ROSC結(jié)束為止期間,進(jìn)行了詳細(xì)的時間記錄,急救時腎上腺素用量也并非完全相同,但以上因素在組間對比后并無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究選取的權(quán)威NDS評分〔11〕,更加系統(tǒng)化、準(zhǔn)確化的評估大鼠神經(jīng)功能,分值越高神經(jīng)功能缺陷越明顯。細(xì)胞在凋亡的早期會出現(xiàn)特征性的萎縮,核固縮(染色質(zhì)的不可逆凝聚)也同時發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段。本研究CA/CPR模型神經(jīng)細(xì)胞凋亡的病理染色與Chenoune等〔25〕研究結(jié)果一致。

Bax是Bcl-2的蛋白家族的重要成員。CA后,腦缺血/再灌注損傷達(dá)到一定程度,神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài),產(chǎn)生大量自由基,刺激信號使促凋亡成員如Bax和Bak激活,Bax和Bak通過形成線粒體外膜通透性(MOMP)復(fù)合物來啟動細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜上形成一個稱為通透性轉(zhuǎn)換孔(PT孔)的孔。之后線粒體釋放促凋亡蛋白,如細(xì)胞色素C等形成凋亡體,從而使凋亡體激活Caspase-9的啟動,進(jìn)而導(dǎo)致Caspase-3的激活,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是在細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的中心分子,隸屬于Caspases蛋白質(zhì)家族,正常細(xì)胞中以不活躍的前體或酵素形式存在于細(xì)胞內(nèi)。凋亡程序不論通過外源途徑刺激還是內(nèi)源途徑轉(zhuǎn)化,最后均可導(dǎo)致Caspase-3及家族成員激活,并導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)變化,破壞細(xì)胞骨架與核蛋白等,均為細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)。Bcl-2是位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或核膜中的跨膜蛋白,主要起抗凋亡作用,具有4個不同的Bcl-2同源(BH)區(qū)域的多區(qū)域蛋白,即BH1～BH4。其中BH4是抗凋亡活性所必需的。為了避免細(xì)胞凋亡,Bcl-2或Bcl-xl等凋亡蛋白必須結(jié)合和隱藏BH3蛋白結(jié)合位點(diǎn)以阻止Bax/Bak激活。Bcl-2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),通過抑制促凋亡蛋白來防止凋亡。Bcl-2或Bcl-xl過表達(dá)將抵消促凋亡蛋白針對線粒體外膜產(chǎn)生的改變,進(jìn)而引起膜通道電位的變化,最終會導(dǎo)致線粒體腫脹和線粒體膜外膜的破裂,此時,BH3位點(diǎn)被占據(jù),因此阻止了Bax/Bak激活,進(jìn)而通過與B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白(p28Bap)31結(jié)合介導(dǎo)Caspases的抑制,從而發(fā)揮抗凋亡作用〔26〕。

本文中大鼠生存統(tǒng)計中48 h成活率CPR組成活率較之XNGC組、AGNH組降低。結(jié)果提示,醒腦灌腸液和安宮牛黃丸的可能達(dá)到相近的神經(jīng)保護(hù)效果。

綜上,醒腦灌腸液在腦卒中患者及基礎(chǔ)實驗的抗凋亡、抗炎相關(guān)研究比較完善。本課題拓展了該方劑應(yīng)用范圍的可能性,并且為臨床CPR后腦損傷及昏迷患者提供了治療方向。醒腦灌腸液方劑不僅價格經(jīng)濟(jì),而且給藥方式為灌腸法,為CPR后的昏迷患者給藥提供方便。本研究在基礎(chǔ)實驗方面提供了與安宮牛黃丸治療效果可能相似的實驗數(shù)據(jù),為醒腦灌腸液更廣泛的應(yīng)用于臨床提供可能。本研究不足之處在于僅探索醒腦灌腸液對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的研究,并未探索其上游通路蛋白的表達(dá)。