康益膠囊對缺血再灌注腦水腫大鼠腦組織AQP4、MMP-9蛋白的影響

張奎明 葛鸞蝶 崔應麟 陳冠廷 葛文靜

(1河南中醫藥大學,河南 鄭州 450002;2河南省中醫院腦病科)

缺血性腦卒中是由于腦供血動脈急性閉塞或嚴重狹窄,腦供血不足所致的局部腦組織壞死性疾病,具有高致殘率、高致死率的特點,嚴重威脅老齡人口的生命健康〔1,2〕。血管再通療法雖可部分恢復腦部供血、消除有毒代謝物,亦會誘發腦水腫、加重腦組織損傷〔3〕。腦缺血再灌注損傷已成為腦卒中臨床治療亟待解決的問題,因此,需深入研究缺血再灌注損傷的防治策略。中醫藥具有多靶點、多環節、整體治療的特點,對腦缺血的治療發揮重要作用〔4〕。腦缺血再灌注損傷歸屬于中醫學“中風”范疇,中醫對該病因機證治的論述較為豐富,王清任于《醫林改錯·半身不遂論》記載:“半身不遂,虧損元氣,是其本源……無氣則不能動,不能動,名曰半身不遂”“元氣既虛,必不能達于血管,血管無氣,必停留而瘀”,開拓性地提出“氣虛血瘀”理論。現代中醫研究表明,缺血性腦卒中是在氣虛的基礎上,風、火、痰、瘀彼此作用,相互轉化而發病〔5〕。王永炎院士認為該病本虛標實,本虛以“氣虛”多見,標實以“痰瘀”為主,并謹守中醫“急則治標,緩則治本”原則,急性期側重“化痰散瘀”,恢復期重在“益氣培本”〔6〕。因此,氣虛為缺血性腦卒中基本病機,痰濁、血瘀是該病主要致病因素及病理產物。

康益膠囊由紅參、丹參、三七、土鱉蟲、水蛭、大黃研末而成,具有益氣活血、化痰散瘀之效,臨床療效顯著〔7〕。前期臨床研究發現,康益膠囊可上調缺血性腦卒中患者血清中腦源性神經營養因子、血管內皮生長因子及神經生長因子含量,改善缺血腦組織損傷、降低患者顱內壓、提升患者生活質量〔8〕。實驗研究表明,康益膠囊通過增強大鼠缺血側腦組織中谷胱甘肽過氧化物酶及過氧化氫酶表達,減輕腦組織氧化損傷、改善大鼠腦水腫,亦能減少乳酸脫氫酶的釋放,保護受損神經元〔9〕。上述研究證實康益膠囊可降低缺血側腦含水量,但具體作用機制尚不明確,因此,本研究以腦缺血再灌注大鼠為模型,探討康益膠囊對腦缺血后水通道蛋白(AQP)4、基質金屬蛋白酶(MMP)-9蛋白的干預作用,為康益膠囊治療缺血性腦卒中提供理論依據。

1 資料與方法

1.1動物 清潔級健康雄性SD大鼠72只,體質量(250±30)g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2019-0010。大鼠分籠飼養于河南中醫藥大學中心實驗室清潔級動物房中,在喂養溫度(22±2)℃、相對濕度(50±10)%,人工控制光照、黑暗各12 h條件下,予以Co60輻照維持飼料及去離子水飼養。所有動物實驗由河南省中醫院及河南中醫藥大學第二臨床醫學院倫理委員會批準后進行。

1.2實驗儀器 氣體麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號:R500IF);病理切片機(德國徠卡公司,型號:RM2016);生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號:BX53)、生物組織攤烤片機(型號:JK-6)、脫水機(型號:JT-12J)、包埋機(型號:JB-P5)均購自武漢俊杰電子有限公司;一次性刀片(日本羽毛公司,型號:8093081);精密電子天平(上海海康電子儀器廠,型號:JA203);電熱恒溫干燥箱(上海恒科學儀器有限公司,型號:DHG-9023A);線栓(北京西濃科技有限公司,型號:2636A2);恒溫水浴箱(上海天美科學儀器有限公司,型號:UV1000);Western印跡電泳儀(型號:1645050)、Western印跡轉膜儀(型號:Mini trans-Blot17)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠系統(型號:Mini PROTEAN)、化學發光凝膠成像儀(型號:ChenmiDoc XRS+)均購自美國伯樂公司。

1.3實驗試劑與耗材 異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,批號:30037516);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司,貨號:P0010);CFASany KD PAGE蛋白電泳凝膠制備試劑盒Ⅰ型(陜西中暉赫彩生物醫藥科技有限公司,貨號:PE008);彩色預染蛋白(香港柯非特生物科技有限公司,貨號:LBP6510-02);4×蛋白上樣緩沖液(貨號:P1016)、高效RIPA裂解液(貨號:R0010)、電化學發光(ECL)超敏發光液(貨號:PE0010)、4×蛋白上樣緩沖液(貨號:P1016)、2%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色液(貨號:G3005)均購自北京索萊寶科技有限公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司,貨號:IPVH00010);抗AQP4抗體(武漢博士德生物公司,貨號:BA1560);抗MMP9抗體(武漢博士德生物公司,貨號:PB9669);羊抗兔 IgG二抗(貨號:SA00001-2)、抗β-actin抗體(貨號:20536-1-AP)均購自武漢三鷹生物技術有限公司;蘇木素(美國Sigma公司,貨號:H9627);伊紅Y(貨號:71014544)、無水乙醇(貨號:10009218)、二甲苯(貨號:10023418)、鹽酸(貨號:10011018)、包埋石蠟(貨號:69019361)、中性樹膠(貨號:10004160)均購自中國醫藥集團有限公司。

1.4藥物 康益膠囊(按照人參、丹參、土鱉蟲、水蛭、三七、大黃1.0∶3.0∶2.0∶1.0∶1.0∶0.8比例,中藥飲片研末配制而成)、銀杏葉片(揚子江藥業集團有限公司,國藥準字Z20027949,9.6 mg∶2.4 mg/片)購自河南省中醫院藥房,上述藥物均由100 ℃沸水制備懸濁液,常溫冷卻,4 ℃貯藏備用。

1.5制備模型 參照文獻造模方法〔10〕,應用線栓法制備大鼠左側大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。術前所有大鼠禁食12 h,自由飲水,5%異氟烷氣體吸入麻醉大鼠,將麻醉大鼠以仰臥位固定于手術板,備皮后,在大鼠頸部正中線開口,逐層鈍性分離,暴露左側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)及頸外動脈(ECA),分離CCA與迷走神經,并在CCA近心端、ECA近“Y”口分叉處、ICA遠心端各備一根手術線備用,結扎CCA、ECA并用動脈夾夾閉ICA,距ICA、CCA分叉處4 mm位置,以眼科剪在CCA剪一“V”形切口,將尼龍線栓〔長度45 mm,頭端直徑(0.36±0.02)mm〕半球端由切口插入ICA,向前緩慢推進17～20 mm,略遇阻力為止,記錄時間。結扎ICA以固定栓線,逐層消毒縫合手術開口,栓線殘端1 cm留于皮外,1.5 h后拔出線栓球端,恢復左側腦部血供,假手術組大鼠只作分離,不插入線栓。造模室溫24～25 ℃,大鼠體溫36.5～37.5 ℃。

根據Zea-Longa五分法評分標準〔11〕,術后24 h對大鼠進行神經行為學評分。評分標準:0分,行為正常,無神經功能缺損;1分,提尾不能完全伸展右側前爪;2分,提尾右側前肢內收,爬行右側轉圈;3分,站立不穩,向右側跌倒;4分,意識障礙,不能行走。保留1～3分大鼠,剔除0分、4分大鼠。

1.6分組與給藥 采用隨機數字表法將SD雄性大鼠分為假手術組、模型組、康益膠囊低、中、高劑量組、銀杏葉組,每組12只。根據成人標準體質量每日攝入總量3 g,依據人與大鼠之間用藥劑量換算系數表計算大鼠用藥量〔12〕,配制康益膠囊中劑量組(540 mg/kg)、低劑量組(270 mg/kg)、高劑量組(1 080 mg/kg),銀杏葉組(680 mg/kg),假手術、模型組則給予同等體積的溶劑。在左側大腦恢復血供后24 h后行灌胃給藥,每日按時1次,持續給藥14 d。

1.7觀察指標

1.7.1改良神經功能缺損評分(mNSS評分)〔13〕mNSS評分評價腦缺血大鼠神經功能缺損情況,評分項目包含感覺、運動、平衡及反射功能等多個方面,全面評估腦缺血再灌注大鼠神經功能缺損恢復情況,總評分為18分,腦損傷與分值呈正比,評估選擇術后第1、3、7、14天,固定相同時間節點進行。

1.7.2腦水腫測定 灌胃14 d、評分結束后,于各組隨機選取6只大鼠,氣麻后處死,斷頭取腦,舍棄嗅球、小腦及小腦旁絨球,以生理鹽水沖洗大腦表面血漬,濾紙吸附表面水分后,稱取腦組織濕重質量,將大腦在100 ℃烘箱中干燥24 h,再稱取腦組織干重質量。腦含水量百分比按照腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%計算。

1.7.3TTC染色測定腦梗死面積 腦水腫測定完成后,麻醉處死各組剩余6只大鼠,迅速斷頭取出完整大腦,生理鹽水沖洗后,吸干表面水分,置于-20 ℃冰箱冷凍30 min,將凍硬大腦置于大鼠腦切片模具中,在腦視交叉前后1 mm處,作冠狀切片,在2%TTC染色液中,37 ℃避光孵育30 min,期間翻片,確保染色充分,隨后浸泡于10%多聚甲醛固定,缺血腦組織呈白色,正常腦組織呈紅色,應用Image Pro Plus計算切片腦梗死面積,腦梗死面積百分比=(梗死面積/全腦總面積)×100%。

1.7.4蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測病理變化 TTC染色完成后,將每組6只大鼠缺血側大腦組織視交叉至枕極部分,置于10%甲醛溶液固定,先使用梯度酒精對腦組織進行脫水處理,后經二甲苯透明處理,再由60 ℃石蠟浸泡,最后使浸蠟組織塊包埋于蠟塊中。使用蠟塊制備5 μm厚度的石蠟切片,經切片脫蠟、蘇木素染色10 min、分化液分化、返藍液返藍、伊紅復染、去離子水水洗、脫水、透明、風干、封片、鏡檢。

1.7.5Western印跡法檢測AQP4、MMP-9蛋白表達 取各組剩余大鼠缺血側腦組織腦前極至視交叉部分,將腦組織置于裂解液中,在勻漿機1 500 r/min、8 min中勻漿,提取上清液,BCA試劑盒對蛋白濃度定量,加入1×蛋白質上樣緩沖液,在100 ℃水浴加熱5 min,使蛋白變性,配膠、上樣進行電泳分離蛋白,后將凝膠蛋白印跡轉印至PVDF膜中,用5%脫脂奶粉封閉1 h,在4 ℃冰箱一抗(AQP4,1∶1 000;MMP-9,1∶1 000;β-actin,1∶2 000)孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)清洗5 min,重復5次后,二抗羊抗兔IgG(1∶3 000)孵育1 h,TBST清洗5次后,使用超敏發光液在凝膠成像儀中檢測蛋白印跡,而后使用Image J軟件量化目的蛋白條帶的灰度值,并以β-actin作為內參蛋白,對比分析目的蛋白表達。

1.8統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD法檢驗,統計標準α=0.05。

2 結 果

2.1各組mNSS評分結果 如表1所示,假手術組無神經功能缺損癥狀,剩余各組均呈現神經功能缺損。與假手術組相比,各時間點模型組均有明顯神經功能缺損(P<0.01)。與模型組相比,康益膠囊低、中劑量組灌胃第1天無顯著差異(P>0.05),其余時間點治療組均顯著改善神經功能缺損(P<0.01)。與康益膠囊低劑量組相比,各時間點高劑量組、銀杏葉組治療效果均顯著(P<0.05)。與康益膠囊中劑量組相比,各時間點高劑量組效果明顯(P<0.05)。灌胃第14天,康益膠囊高劑量組治療效果與銀杏葉組存在顯著差異(P<0.05)。治療組均能改善MCAO大鼠神經功能缺損,且康益膠囊高劑量組治療效果優于其余各組。

表1 各組不同時間點mNSS評分結果比較分,n=12)

2.2各組腦含水量及腦梗死面積比較 如表2所示,與假手術組相比,模型組腦組織含水量及腦梗死面積明顯上升(P<0.01);與模型組相比,康益膠囊低、中、高及銀杏葉片組腦組織含水量及腦梗死面積明顯下降(均P<0.01);與康益膠囊低劑量組相比,康益膠囊中、高及銀杏葉片組腦組織含水量及腦梗死面積顯著減少(均P<0.01);與康益膠囊中劑量組相比,康益膠囊高劑量組和銀杏葉片組腦組織含水量及腦梗死面積顯著下調(均P<0.05)。與康益膠囊高劑量組相比,銀杏葉組腦梗死面積百分比顯著升高(P<0.05)。康益膠囊可改善大鼠腦缺血損傷,且高劑量組治療效果較好。治療組均能改善MCAO大鼠腦水腫,而康益膠囊高劑量組效果最佳。如圖1所示,假手術組腦切片呈紅色,未見梗死區域;模型組腦切片缺血側出現大面積白色梗死區,治療組相比模型組梗死面積均減少,說明康益膠囊和銀杏葉片可改善大鼠腦缺血損傷。

表2 各組腦組織含水量及腦梗死面積比較

2.3各組腦組織病理形態變化 如圖2所示,假手術組腦皮層神經元結構及形態完整,胞膜完整,胞漿充盈,核仁清晰;模型組神經細胞結構改變,皮質區廣泛水腫,細胞間隙增大,部分細胞腫脹,核仁固縮或變淺,細胞數目明顯減少;與模型組相比,治療組缺血側腦組織隨著中藥劑量的增加,水腫減輕,神經細胞形態改善、數目增加,細胞腫脹及核固縮、溶解減輕,其中康益膠囊高劑量組腦組織損傷較為輕微。

圖2 各組腦組織病理形態(HE染色,×400)

2.4各組腦組織AQP4及MMP-9蛋白表達 如圖3、表3所示,與假手術組相比,模型組腦組織AQP4及MMP-9蛋白表達顯著上升(均P<0.01);與模型組相比,各治療組腦組織AQP4及MMP-9蛋白表達均顯著降低(均P<0.01)。

圖3 各組AQP4、MMP-9蛋白表達

表3 各組腦組織AQP4、MMP-9蛋白相對表達量

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是復雜、多因素過程,由于動脈栓塞或狹窄致使缺血腦組織能量衰竭、去極化和興奮性損傷,導致細胞毒性及血管源性水腫,繼而誘發神經元死亡〔14,15〕。缺血性腦水腫通常由細胞毒性水腫引起,而后發展為血管源性水腫,且伴有廣泛性腦損傷〔16〕。細胞毒性水腫是由于細胞膜上鈉、鉀泵功能受損導致離子失衡,水分向胞內遷移、聚集,最終誘發細胞水腫。而星形膠質細胞是細胞毒性水腫的主要類型,反應性星形膠質細胞通過釋放血管生成因子,該因子在中樞神經系統內皮細胞中傳遞抑制信號,下調緊密連接蛋白及閉合蛋白的表達,破壞血腦屏障〔17,18〕。血管源性水腫是血腦屏障破壞的結果,血腦屏障通透性增加導致離子和蛋白質進入血管外空間,水分子順濃度梯度滲透、聚集于大腦間質,誘發腦水腫〔19〕。

AQP4是一種疏水性跨膜小分子單體,在腦血管周圍星形膠質細胞終足中表達,并通過參與水分子通過血腦屏障的運動,控制神經系統的水穩態〔20,21〕。研究表明,腦缺血發生后,AQP4在反應性星形膠質細胞中高表達,促進該細胞遷移,而反應性星形膠質細胞遷移導致細胞內外滲透壓改變,AQP4在星形膠質細胞前端片脂中發生極化,水分子流入胞內,導致細胞毒性水腫〔22〕。此外,由AQP4介導的星形膠質細胞腫脹可促進谷氨酸興奮性毒性、一氧化氮產生及細胞因子如:白細胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子-α的釋放,從而加重缺血區血腦屏障損傷,誘發腦水腫〔23〕。因此,AQP4在血腦屏障周圍星形細胞終足的優先表達,對腦缺血再灌注損傷性水腫的治療,具有重要意義。

MMP-9是一種活性部位含有鋅離子的內肽酶,可消化細胞外基質成分包括層黏連蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖,在腦缺血再灌注過程發揮作用〔24〕。腦組織缺血區域MMP-9表達增強,通過降解細胞外基質提高血腦屏障的通透性,從而促進血管源性腦水腫,增加炎癥細胞浸潤,促進炎癥反應和凋亡,從而加劇腦缺血再灌注損傷〔25,26〕。實驗研究表明,在局灶性腦缺血模型中,MMP-9基因缺陷小鼠相比普通小鼠,具有較強的血腦屏障保護作用〔27〕。臨床研究發現,腦梗死患者梗死核心及缺血半暗帶區域中MMP-9表達明顯上調,在梗死核心區,表達于浸潤的中性粒細胞及活化的小膠質細胞,而在缺血半暗帶區,主要表達于巨噬細胞,表明MMP-9與缺血性腦損傷和繼發性腦水腫密切相關〔28〕。因此,抑制MMP-9的表達可減輕血腦屏障功能障礙及缺血性腦損傷。

綜上所述,腦缺血再灌注可導致腦組織損傷、神經功能障礙、腦水腫,同時伴有血腦屏障通透性增加、炎癥因子浸潤、神經細胞凋亡等病理改變〔29〕。本研究結果說明,康益膠囊具有改善腦缺血再灌注損傷,抗腦水腫的作用。康益膠囊可改善腦缺血再灌注損傷、降低繼發性腦水腫,發揮腦保護作用,但腦缺血再灌注損傷病理機制復雜,康益膠囊作用機制是否與炎癥級聯反應、細胞凋亡有關及對血腦屏障的保護機制,有待深入研究。