基于網絡藥理學探討丹參治療重癥哮喘的作用機制

鄧安妮，陳 玉，李沁瑤，胥崟崧

( 成都中醫藥大學，四川 成都 610075)

支氣管哮喘是兒童期最常見的慢性呼吸道疾病，臨床主要表現為反復發作的喘息、胸悶、咳嗽或呼氣性呼吸困難，目前發病原因尚未完全清楚。哮喘遷延不愈可引起氣道重塑、肺功能損傷等，而其重癥急性發作可迅速發展為呼吸衰竭甚至危及生命。據報道，兒童哮喘的發病率可能高達5%[1-2]。重癥哮喘的患病率在成人隨機樣本中為1.1%，在哮喘人群樣本中的占比為9.5%。與其他哮喘患者相比，重癥哮喘患者有更多的癥狀、更嚴重的活動受限、心臟病和更高的血液中性粒細胞水平，且其肺功能也較差[3]。雖然重癥哮喘所占比例不大，但給患者帶來了巨大的身體、精神、情感和經濟負擔。近年來，大量研究發現中藥的某些化學成分在重癥哮喘的防治上療效顯著。提示中醫藥多靶點、多環節的整體調節作用在對本病進行防治方面具有潛在優勢。丹參始載于《神農本草經》，善于活血祛瘀，且祛瘀而不傷正。其活血化瘀通血脈之力較強，可將深伏于肺絡之瘀血驅逐于外。中性粒細胞型哮喘是重癥哮喘的一個重要表型。謝欣辛等[4]的研究表明，丹參可通過抑制補體系統的激活來減輕中性粒細胞型哮喘小鼠體內的炎癥。研究證明，丹參可改善微循環，提高耐缺氧能力，且具有一定的鎮靜、鎮痛、抗炎作用[5]。本文將利用網絡藥理學對丹參治療重癥哮喘的分子機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 篩選丹參的潛在靶點

在TCMSP 數據庫中檢索丹參，通過口服生物利用度＞30% 且類藥性＞0.18 篩選成分。丹參成分靶點信息通過 TCMSP 和Swiss Target Prediction 數據庫共同確定，最后通過Uniprot 數據庫規范靶點信息。

1.2 篩選重癥哮喘的靶點

分別在GeneCards、Drugbank 和TTD 數據庫中輸入“severe asthma”，檢索重癥哮喘相關靶點，通過中位數評分篩選靶點。

1.3 共同靶點PPI 網絡

將丹參對應靶點和重癥哮喘的靶點取交集。將交集靶點導入 String 平臺，得到TSV 文件。將PPI TSV文件導入CytoScape 3.9.0，分析其拓撲學參數并以此篩選關鍵靶點。

1.4 富集分析

利用Metascape 數據庫將丹參對重癥哮喘的潛在作用靶點進行KEGG 分析。

1.5 建立中藥-成分-靶標網絡

利用Cytoscape 3.9.0 構建中藥- 成分- 靶標網絡。連接度、介度和緊密度等拓撲參數是評價丹參調治重癥哮喘核心活性成分、核心靶點的主要參考指標。

2 結果

2.1 丹參中的有效成分及其靶點

檢 索TCMSP 數 據 庫，利 用OB 和DL 共 篩 選得 到65 種 有 效 成 分。利 用TCMSP 和Swiss Target Prediction 數據庫預測靶點，在去除重復值后，共得到與有效成分相關的潛在作用靶點680 個。

2.2 重癥哮喘的靶點

在Genecards 中通過中位數評分篩選靶點。同時納入TTD 和Drugbank 獲得的靶點，剔除重復靶點，最終獲得重癥哮喘的靶點693 個。

2.3 構建PPI 網絡

丹參作用于重癥哮喘的共同靶點有165 個，見圖1。將共同靶點導入String 平臺，將生物種類設定為“Homo sapiens”，其余均為默認設置，得到PPI 網絡，見圖2。利用拓撲分析篩選出12 個關鍵靶基因，詳細信息見圖3。

圖1 丹參與重癥哮喘重合的靶點韋恩圖

圖2 丹參作用的165 個共同靶點網絡關系圖

圖3 關鍵靶點網絡節點特征參數

2.4 功能與通路的富集分析

將165 個共同靶點上傳至Metascape 數據庫進行KEGG 富集分析，分析提示參與丹參調治重癥哮喘的主要通路有：PI3K-Akt 信號通路、鈣信號通路、Th17細胞分化信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路，見圖4。

圖4 丹參KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.5 構建中藥-活性化學成分-交集靶點網絡

利用 Excel 將丹參作用于重癥哮喘的活性化學成分、靶點建立網絡和屬性文件，然后導入Cytoscape 3.9.0 軟件。方形代表基因靶點，三角形代表丹參的有效活性化學成分，見圖5。以內置工具Network Analyzer 得到的參數作為評價指標，篩選出最重要的活性化學成分和靶點，見圖5、圖6。

圖5 丹參治療重癥哮喘的“中藥-活性化學成分-交集靶點”網絡

圖6 丹參“中藥-活性化學成分-交集靶點”網絡中核心成分及核心靶點特征參數

3 討論

哮喘屬“哮病”范疇, 重癥哮喘較普通哮喘病情重，其預后差、易反復發作，且對激素治療不敏感，多被現代醫家歸屬于“虛哮”“頑哮”范疇。重癥哮喘病因復雜, 病機多變，多虛實夾雜，現代醫家認為其病因病機多與“感受外邪”“氣閉”“痰阻”“血瘀”“臟腑虧虛”等密切相關[6-7]。“血瘀”是重癥哮喘發生發展的重要影響因素，丹參為常用的活血化瘀藥，也是從瘀論治哮喘時的常用藥。有研究表明，丹參可通過抑制TGF-β1以及MMP-9 的表達來改善哮喘氣道重塑[8]。

本研究得到165 個共同靶點以及對應的62 種活性成分。其中木犀草素、2- 異丙基-8- 甲基菲-3,4-二酮、紫丹參素C、丹參醇A、丹參新醌D 等活性成分的作用較強。推測上述有效成分可能是丹參調治重癥哮喘的重要物質基礎。木犀草素是一種黃酮類化合物[9]，能夠減輕哮喘幼鼠的氣道炎癥, 其可能是通過抑制誘導型一氧化氮合酶/ 一氧化氮信號途徑來發揮作用[10]。余潔等[11]的研究表明，木犀草素可抑制哮喘患兒體內促炎性細胞因子TNF-α、IL-6 的分泌,并通過TLR4/NF-κB 信號通路發揮抗炎作用。氣道重塑是重癥哮喘的病理學基礎。實驗研究證明，丹參醇A（DA）能夠減輕心臟重塑，改善心臟損傷和心肌膠原體積[12]。ICAM-1 和VEGF 與炎癥細胞因子及哮喘嚴重程度密切相關[13]。雖然關于丹參核心化學成分治療重癥哮喘的直接研究較少，但其抗炎、抗血栓形成等作用功效仍被認為可作為治療重癥哮喘的有效途徑。本文通過對丹參治療重癥哮喘共同靶點網絡的構建，得到PTGS2、AR、ESR1、OPRM1、ADRB2 5 個核心靶點。COX-2（PTGS2）蛋白的升高是以失調炎癥為代表的呼吸系統疾病病理生物學改變的關鍵影響因素[14]。有研究指出，木犀草素能夠減輕哮喘幼鼠的氣道炎癥與其抗氧化應激和抑制COX-2 信號通路作用密切相關[15]。研究表明，較高的支氣管 AR 表達和較高的雄激素水平有利于哮喘患者肺功能的改善[16]。雌激素主要通過雌激素受體（ER）ERα 和ERβ 發揮作用，而ERβ 在氣道重塑中發揮著重要作用，其可作為治療重癥哮喘的潛在靶標[17-18]。有研究指出，β2- 受體激動劑可抑制氣道平滑肌增殖及氣道壁的增厚, 從而干預氣道重塑[19]。研究表明，阻斷PI3KAkt 信號通路可延緩氣道重塑進程[20]。MAPK 信號通路在哮喘發病進程中可介導免疫／炎癥細胞反應以及氣道結構細胞反應[21]。T 輔助17（Th17）細胞在重癥哮喘的發病機制中起到重要作用。Yes 相關蛋白(YAP)/ 缺氧誘導因子-1α (HIF-1 α)/microRNA-182(miR-182)/早期生長反應 2 (EGR2) 軸可參與介導哮喘中的 Th17 細胞分化，影響哮喘的嚴重程度[22]。有研究[23]表明，抑制IL-17/NF-κB/MAPK 通路可以緩解OVA誘導的小鼠哮喘模型氣道高反應性和氣道炎癥。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法初步闡釋了丹參對重癥哮喘的作用是通過木犀草素、丹參醇A、紫丹參素C 等活性成分作用于PTGS2、AR、ESR1、ADRB2 等核心靶點，并通過PI3K-Akt 信號通路、Th17細胞分化信號通路、HIF-1 信號通路等與炎癥、免疫等密切相關的通路來實現的，這為臨床合理運用丹參和相關新藥的開發提供了科學依據。但本研究未考慮中藥成分的劑量以及煎煮后的化學成分和活性成分在體內的代謝物等因素，故后續仍需在此基礎上進行相關動物或細胞實驗驗證。