三文魚刺身中菌落總數不確定度評定

寧禮信，周敏，黎子林，蘇水嬌，高志城，張任廣

1. 廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學測量與應急檢測技術重點實驗室，廣東省原位電離質譜分析工程技術研究中心（廣州 510070）；2. 中國檢驗檢疫科學研究院粵港澳大灣區研究院（中山 528437）

食品安全是一直以來備受關注的話題[3]，菌落總數又是評價食品衛生狀況的一項重要指標[4-5]，因此對食品中菌落總數進行測量不確定度的評價[6-10]非常必要。國際上對各種食品中菌落總數不確定度的測量都有豐富經驗，但對生食水產品中菌落總數不確定度的評定研究較少，試驗依據GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[1]檢測三文魚刺身樣品的菌落總數，按照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[2]規范分析檢測結果不確定度的來源并建立數學模型，分別對引入的不確定度分量進行評定，以合成計算的方法評定菌落總數的不確定度[11-13]，通過有效評定菌落總數測定結果的不確定度，進一步提升實驗室檢測數據的準確度和可靠性。

1 材料與檢測方法

1.1 測試樣品

研究測量不確定度評定實例為單一樣品的重復測量，測試樣品為三文魚刺身。即食生制動物性水產品的微生物限量應符合GB 10136—2015《食品安全國家標準 動物性水產制品》[14]，該標準采取的是三級采樣方案，其菌落總數的限值為n=5，c=2，m=5×104CFU/g，M=105CFU/g，即：在5個樣品中，允許全部樣品中相應微生物指標檢驗值≤5×104CFU/g；允許有≤2個樣品其相應微生物指標檢驗值在5×104CFU/g和5×105CFU/g之間；不允許有樣品相應微生物指標檢驗值大于105CFU/g。根據已有檢測經驗，三文魚菌落總數的稀釋度確定為10-1，10-2和10-3這3個稀釋度。

1.2 材料與設備

平板計數瓊脂（250 g，北京陸橋技術股份有限公司）；電子天平（T1000Y，常熟市雙杰測試儀器廠）；萬級潔凈實驗室；高壓蒸汽滅菌器（HVA-110，日本Hirayama公司）；潔凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司）；生化培養箱（1400型，新西蘭 Contherm Scientific Ltd.）。

1.3 試驗方法

1.3.1 檢測依據

菌落總數測定根據GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[1]。

1.3.2 檢測過程

以無菌操作將25 g檢樣生食水產品（三文魚刺身）放于盛有225 mL滅菌生理鹽水無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1～2 min，制成1∶10的均勻稀釋液。用1 mL無菌吸管吸取1 mL 的1∶10樣品勻液，沿管壁緩慢注入含有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管，混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。另取1 mL滅菌吸管，按上述操作方法，制備10倍遞增稀釋勻液，如此每遞增稀釋1次，即換用1支1 mL滅菌吸管。根據對樣品污染情況的估計，選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液，在進行10倍遞增稀釋的同時，吸取1 mL樣品勻液于無菌培養皿內，每個稀釋度做2個平皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入2個無菌平皿內做空白對照。樣品勻液移入培養皿后，應及時將冷卻至48 ℃平板計數瓊脂培養基注入培養皿15～20 mL，并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉，置30±1 ℃生化培養箱內培養72±3 h。記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。

1.3.3 菌落計數

選取菌落數在30～300 CFU、無蔓延菌落生長的平板作為菌落總數。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數，大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用2個平板平均數。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數。平板內上出現菌落間無明顯界線鏈狀生長時，則應將每條鏈作為1個菌落計數。

1.3.4 數學模型

當只有一個稀釋度平板上的菌落在計數范圍內，按式（1）計算。當有2個連續的稀釋度平板上的菌落在計數范圍內，則按式（2）計算。

式中：N為檢測樣品中的菌落總數；∑C為平板菌落總數的和，CFU/g；n1為低稀釋倍數平板個數；n2為高稀釋倍數平板計數；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

2 測量不確定度評定

菌落總數不確定度測量除各種系統因素的影響外，還包括隨機因素的影響[15]。主要對樣品制備過程中引入的不確定度及重復測量時引入的不確定度進行分析。

2.1 樣品制備過程中引入的不確定度—

2.1.1 天平引入的不確定度

試驗所使用的天平最大稱量為1 000 g，檢定分度值為1 g，實際分度值為0.1 g，根據JJG 1036—2008《中華人民共和國計量檢定規程：電子天平》[16]規定，此類天平在0～500 g稱量范圍時的允許誤差為±0.5 g，按矩形分布，，天平稱量引入的相對標準不確定度為。

2.1.2 量筒引入的不確定度

試驗所使用量筒為250 mL，根據JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》[17]規定250 mL量筒容量允許誤差為±2.0 mL，根據CNAS-GL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》[18]，按三角分布處理，即，量筒引入的相對標準不確定度為Urel(量筒)=。

2.1.3 樣品稀釋過程引入的不確定度

樣品稀釋時使用1 mL和10 mL這2種移液槍，用1 mL移液槍吸取1 mL的不同稀釋度溶液，用9 mL移液槍吸取9mL無菌生理鹽水，按照JJG 646—2006《移液器檢定規程》[19]，量取1 mL和9 mL液體時，容量允許誤差分別是±1.0%和±0.6%，取矩形分布，，移液槍引入的相對標準不確定度為。試驗取3個連續稀釋度（10-1，10-2和10-3），樣品稀釋過程中引入的相對標準不確定度為0.012 1。

2.2 重復測量時引入的不確定度

同一樣品重復測量10次，取其平均值作為測量結果，見表1。

表1 10次重復測量的平皿計數結果

結果數據發散性大，用常規的直接根據平均值得到標準偏差的方法顯得有些不合理。通常的做法是取對數以后再用常規的貝塞爾方法進行計算。

表2 單一樣品重復測量的計算過程

2.3 合成標準不確定度和擴展不確定度

2.4 僅考慮重復測量引入的不確定度

平均值的標準不確定度為μc(lgx)=Urel(菌落)=0.134 6。95%置信概率下包含因子k取2，其擴展不確定度為U=k×μc(lgx)=2×0.134 6=0.27。取反對數，由lgx坐標回到x坐標。由于lgx與x之間的非線性關系，不能直接求擴展不確定度U的反對數，只能給出微生物含量的可能區間。因此確定lgx的取值范圍lgx=4.16±0.27，或寫成3.89≤lgx≤4.43。取反對數后，仍可得7.8×103CFU/g≤x≤2.7×104CFU/g。

2.5 不確定度報告

按照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[1]規定的檢測程序進行，被測樣品微生物菌落總數（10次測量平均值）在7.8×103～2.7×104CFU/g之間。

3 結論

菌落總數是食品微生物檢驗的常規項目之一，不同產品有不同的菌落總數限量標準。當結果處于臨界值時，取值區間就顯得尤為重要[20]。由于菌落總數檢測結果的數據發散性較大，不符合正態分布，不適用于直接計算其標準差，因此需取其對數后進行數據的統計分析，利用貝塞爾公式計算標準不確定度，最終合成菌落總數測定的不確定度，以進一步減少各方面引入的誤差，使檢測結果更加接近真值[21]。從研究結果看，重復測量結果中最大值和最小值相差約4倍，發散較大，與其相比，其他不確定因素都可以忽略，因此僅考慮由測量結果發散引入的不確定度即可。應用不確定度分析和評定能夠更加了解動物性水產制品菌落總數測定過程中的誤差來源，減少測試人員在試驗過程中由于操作不當對檢測結果造成的影響，在結果處于超標臨界值時發揮一定的判定作用，確保檢測數據的準確性、可靠性、科學性和客觀性。