大腸菌群快速檢測紙片的影響因素分析

何榮強

海南省食品藥品檢驗所三亞分所（三亞 572000）

大腸菌群是需氧和兼性厭氧，在一定條件下能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽孢桿菌，生化反應為觸酶陽性、氧化酶陰性、硝酸鹽還原試驗陽性。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希菌（Escherichia）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella）等。大腸菌群作為衡量食品的一個重要衛(wèi)生指標，其含量表明食品被糞便污染的程度和有無腸道致病菌污染的可能，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。據(jù)國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計結(jié)果顯示，2007—2017年，5.6%的國內(nèi)微生物食源性疾病事件是由大腸菌群引起的[1]。

快速檢測紙片是將選擇性培養(yǎng)基和目標菌株的顯色底物混合后依附于濾紙片上制成的檢測紙片，菌體通過吸收濾紙片的培養(yǎng)基生長繁殖。因檢測前處理簡單，處理時間短，檢測后無污染性物質(zhì)，符合環(huán)保要求，具有方便、快捷、經(jīng)濟等優(yōu)點，給檢驗工作帶來很大便利。快速紙片可同時進行取樣和接種工作，減少二者操作的時間差進而在一定范圍內(nèi)避免不必要的細菌增殖帶來的污染，從而得到更加真實的檢驗結(jié)果。快速紙片在節(jié)省人力、物力上也提供技術(shù)保障，許多一線檢測機構(gòu)因場地所限，不便購買更多儀器設備來滿足檢測需求，而采用紙片法則很好地解決這個問題[2]。美國官方分析化學家協(xié)會（AOAC）官方方法990.12《食品中細菌總數(shù)的檢測再水化干膜法》[3]和加拿大的MFHPB-33食品菌落總數(shù)3M法[4]都采用紙片法檢測食品中菌落總數(shù)。但國內(nèi)實踐中，只有GB 14934—2016《食品安全國家標準 消毒餐（飲）具》附錄B大腸菌群檢驗[5]及GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》4.2菌落總數(shù)測試片[6]，采用快速紙片法檢驗。盡管快速紙片法和國標傳統(tǒng)方法檢驗結(jié)果在統(tǒng)計學中沒有太大差別[7]，但是實踐發(fā)現(xiàn)快速紙片法檢驗的結(jié)果有時也會出現(xiàn)結(jié)果模糊不清，不易判斷，檢驗結(jié)果少于實際菌落數(shù)等情況[8]，故對此問題影響因素進行一些深入探討。

1 產(chǎn)品研發(fā)工藝影響

國內(nèi)尚無統(tǒng)一的大腸菌群檢測紙片質(zhì)量鑒定標準，生產(chǎn)企業(yè)無法進行統(tǒng)一有效的生產(chǎn)質(zhì)控。此外，不同生產(chǎn)企業(yè)有著各自的產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)路線，難免會對檢驗結(jié)果的準確性造成不同程度影響。

1.1 紙片配方的成分影響

有試驗采用紙片配方的正交試驗分析對測定大腸菌群影響較大的4個因素，分別是乳糖、膽鹽、蛋白胨和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC），即提供細菌充足的碳源、氮源，同時合適濃度的膽鹽和TTC，對保持大腸菌群的優(yōu)勢生長同時抑制其他細菌并在紙片上有很好的顯現(xiàn)是非常必要的[9]。菊粉添加到大腸菌群檢測紙片中可以明顯提高飼料大腸菌群檢測紙片的靈敏度和準確性，且陽性樣本檢出率明顯提高[10]。快速測試紙片配方上的不斷改進是影響檢驗結(jié)果的重要因素之一。

1.2 添加劑的影響

添加適量的增稠劑可以使紙片浸液體系具有優(yōu)良的增稠性、穩(wěn)定性和水溶性，如0.1%～0.2%質(zhì)量體積比的卡拉膠或魔芋膠、0.1%～0.3%黃原膠等增稠劑的使用均可起到良好的效果[11]。添加乳化劑可使紙片各溶質(zhì)處于良好的分散狀態(tài)，會增加紙片測試的均勻度和顯色效果[12]。

1.3 pH對紙片的影響

紙片浸液在pH 6.5～7.0時，靈敏度最高，若pH低于6.0，紙片整體顏色偏黃，難以辨明是否有黃暈。在大腸菌群脫氫酶作用下，紙片浸液中的TTC接受氫生成紅色的三苯甲胺和菌落周圍產(chǎn)生的大量黃暈相疊加易呈現(xiàn)橙色[13]，易出現(xiàn)假陽性或抑制菌落生長而出現(xiàn)假陰性；若高于pH 7.0，大腸菌落數(shù)量少時，發(fā)酵產(chǎn)酸不足，出現(xiàn)可能檢不出的假陰性。

1.4 酸堿指示劑的影響

應從反應底物以及指示劑變色范圍內(nèi)的pH考慮選擇合適的酸堿指示劑。如溴甲酚紫pH變色范圍5.2～6.8，大腸菌群通過發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使紙片pH下降，可使其顯示黃色，反之為紫色。由于指示劑濃度過高或過低均會影響紙片顯色變化的效果，從而影響判斷，故溴甲酚紫質(zhì)量濃度要控制在一定合理范圍內(nèi)，既不會濃度偏高而抑制大腸菌群的生長，也不會因濃度過低，使紙片上菌落紅點清晰，但菌落周圍產(chǎn)生的黃暈不明顯，而造成假陰性[14]。

1.5 紙片制作參數(shù)影響

濾紙品質(zhì)、吸附能力、表面密度等均會對紙片結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，如：濾紙孔過大，紙片雙面都有菌落生長而無法計數(shù)；濾紙保水性差，無法保持充分濕度，不利于菌體生長；濾紙表面密度不均，培養(yǎng)基浸液分布不均，采樣后也無法很好的擴散，致菌體生長分布不均。此外，2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC）用量要求需嚴格保證既不能抑制菌體生長，又能使現(xiàn)象顯著能夠觀察[15]。紙片制作滅菌溫度過高，培養(yǎng)基浸液溫度過低，烘干溫度偏高等也可影響紙片的質(zhì)量，如出現(xiàn)紙片顏色不一致、色斑等。

2 檢測方式方法影響

2.1 不同類型檢品影響

快速紙片法在檢測餐具、糕點、水質(zhì)與發(fā)酵法檢測結(jié)果符合率可達95%以上，但冷凍飲品、鹵菜等檢測結(jié)果符合率較低[16]。不同類型的檢品因其成分不同，pH不同，會對該方法有影響，即檢品成分越復雜，干擾因素則越多，對檢測結(jié)果的影響就越大。餐具、水質(zhì)其成分對方法的干擾小，檢測結(jié)果準確度就高；反之，冷凍飲品、鹵菜在pH、色素、鹽度方面差異較大，檢測結(jié)果準確度就低。

2.2 采樣操作和人員影響

有國標法的應嚴格按照其進行采樣[如GB 14934—2016《食品安全國家標準 消毒餐（飲）具》]。現(xiàn)場采樣人員的無菌操作、是否按紙片操作說明流程、操作粘貼時間的長短、是否夾取紙片出現(xiàn)破損、是否作空白對照、檢驗人員的高度主觀分析判斷能力及專業(yè)熟練度等都會直接影響檢測結(jié)果。

2.3 接種方式和接種量影響

濕式紙片接種方式和接種量一般應嚴格按照其產(chǎn)品說明書或國家標準方法進行，尤其注意接種時紙片的黏貼或涂抹位置應具有代表性。

干式紙片（以FilmplateTM為例）按“5點法”滴加接種，有試驗表明：接種量（稀釋后）1.0±0.1 mL時，紙片上形成單個紅色菌落并顯示出典型特征；接種量≤0.7 mL時，紙片易干，色澤暗淡且反應不典型；接種量1.3 mL時，紙片全為淡紫色并有紅暈狀；接種量≥1.5 mL時，紙片全為淡紫且無紅暈。紙片吸水量與反應結(jié)果密切相關(guān)，應以紙片被檢液浸透而又無多余水分滲出為宜，一般每張（25 cm2）紙片可吸收約1 mL檢液[17]。“5點法”滴加接種并控制接種量1 mL，可使菌落生長更清晰、更典型，從而增加大腸菌群計數(shù)的準確性和一致性。

2.4 紙片重疊數(shù)量和培養(yǎng)時間影響

采樣或點樣結(jié)束后，應控制紙片的重疊數(shù)量，一般重疊數(shù)量小于10張，紙片經(jīng)培養(yǎng)均可形成典型的大腸菌落。若重疊數(shù)量過多，可能出現(xiàn)菌落融合、擴散，邊界不清的現(xiàn)象，會影響到大腸菌群計數(shù)。在36±1 ℃條件下，培養(yǎng)16～18 h即可觀察結(jié)果。在實際檢測中，培養(yǎng)約14 h時，可對紙片進行一次觀察，若已出現(xiàn)少量典型菌落可繼續(xù)培養(yǎng)至16 h。若菌落數(shù)較多，培養(yǎng)時間過長同樣也可能出現(xiàn)菌落融合，邊界不清的現(xiàn)象，從而影響大腸菌群計數(shù)。

2.5 檢驗結(jié)果不典型影響

在紙片法觀察結(jié)果時，必須考慮樣品的各種因素。雖然生物酶作用特異性和培養(yǎng)液的選擇性對紙片法較高的準確性提供保證，能夠很好的觀察典型的陽性或陰性反應，但無法觀察是否產(chǎn)氣是紙片法重要的缺陷，而產(chǎn)氣是大腸菌群對乳糖發(fā)酵主要特征之一。美國3M公司的PetrifilmTM大腸菌群測試片含有VRB（Violet Red Bile）培養(yǎng)基、冷水可溶性凝膠以及氯化三苯四氮唑（TTC）作為菌落指示劑，三者增強了大腸菌群計數(shù)效果。測試片表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)紅點周圍有氣泡的菌落數(shù)為大腸菌群數(shù)，陽性菌落在測試片上為紅色，同時耐熱大腸菌群發(fā)酵產(chǎn)生的氣體也可直接被觀察到[18]。在結(jié)果判斷上，大腸菌群檢測紙片若保持紫色不變?yōu)殛幮裕患埰凕S并在黃色背景上有片狀紅暈或紅色斑點為陽性，但對紙片為紫色，在紫色背景上呈現(xiàn)紅色斑點則不太好判斷[19]。有試驗表明，在紫色背景上呈現(xiàn)紅色斑點的紙片中，用發(fā)酵法確證有50%左右的陽性率。此時，若僅憑個人經(jīng)驗來判斷陽性或陰性可能會出現(xiàn)錯誤，要考慮樣品的pH和非發(fā)酵菌的存在，在判斷疑似結(jié)果時，應做發(fā)酵法確證試驗來確定非常有必要。此外，還要考慮檢驗采取的方法檢驗結(jié)果偏離是否在可接受的范圍內(nèi)，對這些方法進行一致性驗證，評價檢驗的各項參數(shù)，從而確定方法有效性。

3 結(jié)語和展望

快速紙片法顯色劑系統(tǒng)單一，不能對細菌有針對性區(qū)別計數(shù)，開發(fā)更穩(wěn)定高效顯色物質(zhì)十分重要。基于新型熒光染料其熒光特性及在活細胞內(nèi)的穩(wěn)定性，通過固定染色溫度，時間在20～30 min范圍即可快速檢測[20]，與傳統(tǒng)方法比較具有一致性，且具有較高精密度和準確度[21]。將快速紙片結(jié)合熒光法檢測的應用可對微生物進行高效檢測，該方法比美國分析化學家協(xié)會（AOAC）規(guī)定方法更加節(jié)省時間，進一步簡化試驗準備，便于攜帶，更適用于危害分析及關(guān)鍵控制點（HACCP）的現(xiàn)場監(jiān)管。由于酶解產(chǎn)物均以熒光顯示，并將特定物質(zhì)固定化，同時能夠?qū)κ称分形⑸锖块_展定量分析，故有著更廣泛的應用前景，但紙片熒光法操作時仍要注意避免外源熒光物質(zhì)的非特異性干擾，并做陽性和陰性對照。

快速紙片法雖具有方便、快捷、經(jīng)濟等優(yōu)點，但大腸菌群檢驗結(jié)果的準確性會受到各類因素的影響，遇到判斷結(jié)果有可疑的情況，要全面分析，必要時要做確證試驗來提高大腸菌群檢測的準確性，提升食品安全檢測有效性。各種類型的大腸菌群快速檢測紙片要質(zhì)量穩(wěn)定可靠，就必須保證其檢測的特異性、敏感性、抗干擾性、采樣后穩(wěn)定性[22]等指標有高標準的全面質(zhì)量控制，能更好保證大腸菌群快檢紙片結(jié)果的可靠性和準確性。