實時熒光PCR檢測駝乳營養(yǎng)粉中蛋白的源性成分

劉德，章潔，占忠旭，張玥琦，朱應(yīng)飛

江西省檢驗檢測認(rèn)證總院食品檢驗檢測研究院（南昌 330000）

駱駝乳具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，它富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素，同時還具有抗微生物、抗氧化劑、抗病毒和抗癌等治療特性，此外駱乳還可以添加到其他產(chǎn)品中制成增值產(chǎn)品[1-2]。駝乳營養(yǎng)粉是其制成增值產(chǎn)品的一種，它是以糖、乳及乳制品，適量添加駝乳和其他輔料制成的固體飲料[3]。隨著人們生活節(jié)奏的加快和對醫(yī)療保健方面的重視，營養(yǎng)粉的消費需求日益增長[4]，駝乳營養(yǎng)粉因其方便沖泡、口感清爽香甜且營養(yǎng)豐富，已經(jīng)成為人們經(jīng)常消費的食品之一[1]。但是由于駱駝乳產(chǎn)量不僅受駱駝飼料轉(zhuǎn)化方面的影響，還跟駱駝泌乳期和獨特的氣候天氣息息相關(guān)，導(dǎo)致駱駝乳主要是在干旱或半干旱地區(qū)生產(chǎn)[5-7]，而高昂的人力、運輸和儲藏成本，使得目前駱駝乳價格是牛乳的8～10倍[8]。營養(yǎng)粉中會添加多種蛋白粉[9]，而不同的源性成分的蛋白粉具有相似的口感和化學(xué)成分[10-11]，難免有不法商家會虛假宣傳、以次充好從中牟取暴利。實時熒光PCR技術(shù)通過檢測不同物種的特異性保守序列，已有報道可應(yīng)用于蛋白粉中源性成分的鑒定[12-13]。文章利用實時熒光PCR技術(shù)對23個駝乳營養(yǎng)粉樣本分別檢測駱駝、牛、羊、大豆源性成分，判斷其質(zhì)量狀況及其標(biāo)簽真實性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳營養(yǎng)粉，隨機采購23批不同商家的駝乳營養(yǎng)粉樣品見表2。無水乙醇（純度≥99.7%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；駱駝源性成分核酸檢測試劑盒、羊源性成分核酸檢測試劑盒、牛源性成分核酸檢測試劑盒、大豆源性成分核酸檢測試劑盒（廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

CFX 96 Touch實時熒光PCR檢測儀（BIO-RAD公司）；Multifuge X 1 R冷凍高速離心機（Thermo Fisher Scientific公司）；ScanDrop 100核酸蛋白測定儀（Analytik Jena公司）；Vortex Wizard渦旋震蕩儀（Velp Scientifica公司）；Practum 224-1 CN電子天平（Sartorius公司）；MINIB-100金屬浴恒溫器（北京智云達(dá)科技股份有限公司）。

1.3 試驗方法

駱駝源性成分、牛源性成分、羊源性成分參考GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法》[14]，大豆源性成分參考BJS 201707《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》[15]，結(jié)合試劑盒進(jìn)行測定，每次試驗分別設(shè)置陰性對照、陽性對照、空白對照、內(nèi)參基因，樣品和對照設(shè)置2個平行反應(yīng)體系。引物和探針序列見表1。

表1 引物和探針序列

1.3.1 DNA提取與純化

稱取50 mg駝乳營養(yǎng)粉置于2 mL離心管中，按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取DNA，DNA提取質(zhì)量用核酸蛋白測定儀（A260/A280）檢測。

1.3.2 PCR擴增反應(yīng)

反應(yīng)試劑解凍后，每PCR管中加入20 μL反應(yīng)液，再加入5 μL各樣品DNA模板，蓋好管蓋，渦旋混勻30 s，離心1 min，確認(rèn)各管無氣泡后放入實時熒光PCR儀中，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇MGB。反應(yīng)條件：去污染37 ℃ 10 min，預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 60 s（收集熒光信號），40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

DNA提取液A260/A280的值均在1.6～1.8范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度為10～200 ng/μL，表明DNA模板的純度和濃度均符合后續(xù)PCR的要求。

23份樣品DNA模板按照1.3.2小節(jié)方法進(jìn)行駱駝、牛、羊、大豆源性成分的PCR擴增反應(yīng)，擴增曲線見圖1～圖4。閾值基線設(shè)置為陽性對照熒光強度的1/50，當(dāng)熒光強度達(dá)到閾值時的擴增循環(huán)數(shù)即為Ct值。Ct值≤35.0，判定為陽性；Ct值≥40.0，判定為陰性。此次試驗陽性對照Ct值均小于20.0，陽性樣品Ct值均小于35.0，符合判定要求。如表2所示，駝乳營養(yǎng)粉標(biāo)簽成分均標(biāo)稱含駝乳粉、全脂乳粉，部分標(biāo)稱含有大豆蛋白粉。23個樣品中，檢出駱駝源性成分的為1個，占總數(shù)的4.3%，檢出牛源性成分的為23個，占總數(shù)的100%，檢出羊源性成分的為0個，占總數(shù)的0，檢出大豆源性成分的為13個，占總數(shù)的56.5%。

圖1 駱駝源性成分檢測

圖2 牛源性成分檢測

圖3 羊源性成分檢測

圖4 大豆源性成分檢測

表2 駝乳營養(yǎng)粉檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

駝乳營養(yǎng)粉屬于固體飲料，側(cè)重飲料工藝，奶粉含量較低。雖然所有樣品標(biāo)簽都標(biāo)明添加了駝乳粉，但是添加量存在較大差異，添加量最多的為10%，最少的僅為0.5%。表明駝乳營養(yǎng)粉質(zhì)量良莠不齊。雖然駝乳粉添加量較少的樣品分離后的DNA產(chǎn)量較低，但通過實時熒光PCR擴增，分離出的DNA片段很容易被特異性識別[13]，本次試驗方法參考標(biāo)準(zhǔn)配合試劑盒使用，檢出限為0.1%[14-15]。從試驗結(jié)果可以看出：多數(shù)生產(chǎn)駝乳營養(yǎng)粉的企業(yè)沒有嚴(yán)格按照標(biāo)簽值添加駝乳粉；企業(yè)在蛋白的源性成分選擇上，所有的企業(yè)都添加了牛乳粉，部分企業(yè)添加了大豆蛋白粉，沒有企業(yè)添加羊乳粉，造成這一現(xiàn)在主要原因可能是牛乳粉和大豆蛋白粉價格低廉，駝乳粉和羊乳粉價格相對較貴造成的[8]。

此次試驗利用PCR技術(shù)來檢測駝乳營養(yǎng)粉中蛋白源性成分，特異性和靈敏度較好，可為駝乳營養(yǎng)粉的監(jiān)督抽檢及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)。大致了解了駝乳營養(yǎng)粉中蛋白源性成分的組成及含量，也能更好的維護消費者的合法權(quán)益，促進(jìn)駝乳營養(yǎng)粉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。