保健食品中總黃酮的測(cè)定方法操作關(guān)鍵點(diǎn)優(yōu)化

劉云龍，譚亞男，陸陽，劉忠瑩，王鑫，金麗鑫

1. 四川省食品檢驗(yàn)研究院（成都 610097）；2. 國家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（白酒監(jiān)管技術(shù)）（成都 610097）

黃酮類化合物是自然界中廣泛存在的一類黃色多酚類天然產(chǎn)物，它具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)使其具有多種生物活性[1-3]，具有抗氧化、抗病毒、抑菌、降血脂、改善血液循環(huán)等多種功效[4-8]，具有較高的藥用價(jià)值和保健作用。因此，黃酮類化合物功效指標(biāo)的檢驗(yàn)也成為保健食品檢驗(yàn)工作中的重點(diǎn)。

黃酮類化合物的提取方法有有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法、酶解法、微波提取法、超臨界流體萃取法等[9-15]。保健品生產(chǎn)企業(yè)使用頻度最高的是經(jīng)乙醇超聲提取，黃酮分子結(jié)構(gòu)中羥基和芳環(huán)形成較強(qiáng)的共軛體系，對(duì)紫外光有較強(qiáng)的特征吸收[16]，以蘆丁為對(duì)照品，采用分光光度法在360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，參考《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（2020年版）》[17]保健食品中總黃酮的測(cè)定中第一法。該方法設(shè)備簡(jiǎn)單、污染小、適用性廣、提取效率高、準(zhǔn)確度和精密度高[18-20]，但使用甲苯作為洗脫溶劑，毒性大，另外方法中有部分操作關(guān)鍵點(diǎn)沒有詳細(xì)說明。試驗(yàn)通過考察樣品粉碎粒徑、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、洗脫溶劑、聚酰胺粉的吸附等因素[21-25]對(duì)總黃酮提取率的影響，掌握檢驗(yàn)操作要點(diǎn)，為保健食品中總黃酮的檢驗(yàn)檢測(cè)工作提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（20110037，Lot號(hào)wkq 20030203，99.99%，四川維克奇生物科技開發(fā)有限公司）；聚酰胺粉（0.150～0.075 mm，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙醇、甲苯、甲醇、正己烷（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司），某黃酮類保健品，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Evolution201紫外/可見分光光度計(jì)（美國Thermo公司）；IDH 30超聲波清洗器（德國IRM公司）；CPA 225 D分析天平（德國Sartious公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)方法[17]

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

準(zhǔn)確稱取5.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為50.0 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

精密吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成蘆丁質(zhì)量濃度分別為0，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0和25.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.3.1.2 樣品處理

稱取一定量的試樣，加乙醇定容至25 mL，搖勻，超聲提取20 min，放置，吸取1.0 mL上清液，于蒸發(fā)皿中，加1 g聚酰胺粉吸附，水浴揮去乙醇，轉(zhuǎn)入層析柱（層析柱內(nèi)徑可根據(jù)每個(gè)產(chǎn)品具體情況確定）。用20 mL甲苯洗脫，棄去甲苯液；用甲醇洗脫，合并洗脫液并定容至25 mL，即得。

1.3.1.3 測(cè)定

取標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，于波長(zhǎng)360 nm測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取試樣溶液，于波長(zhǎng)360 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中總黃酮的濃度，平行測(cè)定次數(shù)不少于2次。

1.3.1.4 計(jì)算和結(jié)果表示（式1）

式中：X為試樣中總黃酮的含量，mg/kg；A為測(cè)得的被測(cè)液中黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；M為試樣質(zhì)量，g；V1為測(cè)定吸取試液體積，mL；V2為洗脫后試樣定容體積，mL；V3為提取時(shí)試樣定容體積，mL。

1.3.2 單因素試驗(yàn)考察

分析整個(gè)檢驗(yàn)流程，其中樣品粉碎粒、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取及靜置時(shí)間、聚酰胺粉的吸附能力、洗脫溶劑品種可能是影響總黃酮提取的因素，通過對(duì)這些因素的考察，確定操作關(guān)鍵點(diǎn)。

1.3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于乙醇體積分?jǐn)?shù)沒有具體說明，按照慣例，一般使用95%乙醇，設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)從60%，70%，80%，95%和100%變化，其他因素不變測(cè)定某市售保健品總黃酮含量，考察該因素對(duì)總黃酮提取的影響。

1.3.2.2 超聲提取過程

考察不同超聲時(shí)間和超聲后放置時(shí)間對(duì)于最終總黃酮提取的影響。以超聲20 min和放置15 min為基準(zhǔn)，增加超聲和放置時(shí)間。

1.3.2.3 洗脫溶劑

標(biāo)準(zhǔn)中使用甲苯作為洗脫溶劑，毒性較大，試驗(yàn)考察正己烷和乙醚作為替代，降低試驗(yàn)操作中的風(fēng)險(xiǎn)。

1.3.2.4 聚酰胺粉的吸附能力

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使用1 g聚酰胺粉進(jìn)行吸附，采用不同體積，已知質(zhì)量濃度0.36 μg/mL的蘆丁溶液考察1 g聚酰胺粉對(duì)于總黃酮的吸附上限。吸取1，2，3和5 mL蘆丁溶液于裝有1 g聚酰胺粉的蒸發(fā)皿中，按標(biāo)準(zhǔn)操作測(cè)定總黃酮含量。

1.3.2.5 樣品粉碎度

依次將顆粒狀試樣磨碎，分別通過0.125，0.250，0.600和1.00 mm的篩網(wǎng)，不同粗細(xì)的樣品和不經(jīng)粉碎的樣品同法測(cè)定，考察樣品粉碎程度對(duì)提取的影響。

1.3.2.6 最優(yōu)條件測(cè)定及精密度考察

采取優(yōu)化后的操作過程對(duì)某市售總黃酮保健品樣品進(jìn)行測(cè)定，將樣品混勻，稱取1 g，超聲20 min后浸提12 h，采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取溶劑，洗脫溶劑為正己烷。重復(fù)測(cè)定樣品6次，計(jì)算總黃酮提取量和SRSD。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Microsoft Excel軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值表示，使用Microsoft Word軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取的影響

如圖1所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，黃酮提取得率呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)，體積分?jǐn)?shù)在60%～80%范圍內(nèi)對(duì)總黃酮提取較好，最高點(diǎn)為70%。乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提升，總黃酮的提取反而降低。無水乙醇對(duì)總黃酮的提取量?jī)H有70%乙醇結(jié)果的1/3，這可能和溶劑與總黃酮之間的極性差異相關(guān)。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取的影響

2.1.2 超聲和放置提取過程

在放置時(shí)間相同的情況下，增加超聲提取時(shí)間有助于提升保健品中總黃酮提取率，同樣，相同超聲時(shí)間，增加放置時(shí)間可以提高總黃酮提取率。如表1和圖2所示，放置時(shí)間足夠長(zhǎng)，超過12 h時(shí)，增加超聲和放置時(shí)間都不再提高提取率。放置時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響大于超聲時(shí)間。

表1 不同超聲和放置時(shí)間及結(jié)果

圖2 不同提取時(shí)間組合對(duì)總黃酮提取的影響

2.1.3 洗脫溶劑對(duì)總黃酮提取的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，使用正己烷作為洗脫溶劑對(duì)總黃酮的提取結(jié)果和甲苯結(jié)果沒有顯著性差異，乙醚洗脫結(jié)果略低，但也在標(biāo)準(zhǔn)允許誤差20%范圍內(nèi)。可以使用正己烷作為甲苯的替代溶劑。

2.1.4 樣品粉碎度對(duì)總黃酮提取的影響

經(jīng)過0.125，0.250，0.600和1.00 mm的篩網(wǎng)不同粗細(xì)的樣品和不經(jīng)粉碎的樣品測(cè)定結(jié)果一致，表明經(jīng)過充分的超聲和提取浸泡時(shí)間，保健品粉碎程度對(duì)提取結(jié)果沒有影響。

2.2 最優(yōu)條件測(cè)定結(jié)果

采取優(yōu)化后的操作過程對(duì)某市售總黃酮保健品樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果從12 mg/kg提高到21 mg/kg，提高約80%，SRSD為3.0%。

2.3 試驗(yàn)操作其他關(guān)鍵點(diǎn)

按照該方法測(cè)定保健品中的總黃酮，除單因素考察中的要點(diǎn)外，還需要注意用洗脫溶劑洗脫后，需要用洗耳球排干聚酰胺粉上的洗脫劑，再進(jìn)行甲醇提取。否則可能存在洗脫溶劑不互溶造成的定容體積差異，導(dǎo)致樣品平行測(cè)定結(jié)果差異大。

蒸發(fā)皿揮去乙醇這一過程，可用玻璃棒輕輕攪拌按壓結(jié)團(tuán)的聚酰胺粉，確保乙醇完全揮干，總黃酮完全吸附在聚酰胺粉上。揮干乙醇的蒸發(fā)皿需降至室溫后，再進(jìn)行下一步溶劑洗脫。聚酰胺粉的轉(zhuǎn)移到層析柱，可通過少量正己烷沖洗蒸發(fā)皿的方式。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，按照該方法流程，得到保健食品中總黃酮的最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲20 min后浸提12 h，洗脫溶劑為正己烷。在此條件下，可以達(dá)到總黃酮提取效率最高，測(cè)定結(jié)果從12 mg/kg提高到21 mg/kg，提高約80%。該標(biāo)準(zhǔn)方法操作的關(guān)鍵點(diǎn)主要在于乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲提取后的靜置時(shí)間。