QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法檢測果蔬中苯并烯氟菌唑殘留

葉慧娟

肇慶市食品檢驗所（肇慶 526040）

苯并烯氟菌唑（Benzovindiflupyr）是先正達開發的一類吡唑酰胺類殺菌劑，是琥珀酸脫氫酶抑制劑。苯并烯氟菌唑廣譜、高效，持效期長，作用于病原菌線粒體呼吸電子傳遞鏈上的蛋白復合體Ⅱ，阻礙其能量代謝，進而抑制病原菌的生長，導致其死亡，從而達到防治病害的目的[1-8]。但過量的使用會導致食品中殘留苯并烯氟菌唑，危害人體健康。GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[9]規定苯并烯氟菌唑在部分果蔬中的最大殘留限量（MRL）為0.02～1 mg/kg。已報道僅有常海龍等[10]采用高效液相色譜測定45%苯并烯氟菌唑.嘧菌酯水分散粒劑中有效成分苯并烯氟菌唑和嘧菌酯的含量，隋程程等[11]采用QuEChERS與高效液相色譜-串聯質譜聯用檢測動物源產品中苯并烯氟菌唑殘留，姜宜飛等[12]采用高效液相色譜分析苯并烯氟菌唑原藥，尚缺乏果蔬中苯并烯氟菌唑殘留分析方法的報道。

我國是果蔬生產大國，苯并烯氟菌唑被廣泛應用于果蔬病害的防治，因此檢測果蔬中該類農藥的殘留對消費者的健康非常重要。采用QuEChERS法結合高效液相色譜-串聯質譜建立適用于檢測果蔬中苯并烯氟菌唑殘留方法，該方法簡單快速、分析速度快、回收率高。我國關于食品中苯并烯氟菌唑殘留的檢測方法還沒有相應的國家及部頒標準，國外也鮮見報道，試驗旨在為食品中苯并烯氟菌唑殘留檢測標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯并烯氟菌唑標準物質（純度＞99%，First standard公司）；C18、乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA，美國Aglient公司）；氯化鈉為分析純（廣州化學試劑廠）；乙腈（質譜級，德國Merck公司）。

1.2 儀器與設備

Acquity H-class/X evo TQD超高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀（沃特世公司）；KQ-300DA臺式數控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；Fotectorp氮吹儀（美國Reeko公司）；UMV-3多管漩渦混合器（北京優晟聯合科技有限公司）；高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；GM200刀式混合研磨儀（德國Retsch公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取10.0 g粉碎混勻果蔬樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩2 min；加入3 g氯化鈉渦旋振蕩2 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心6 min；吸取上清液于15 mL具塞離心管中，加入500 mg PSA、500 mg C18，渦旋振蕩2 min，以10 000 r/min離心6 min；取上清液于40 ℃氮氣吹至近干，加1 mL 20%乙腈溶液溶解，渦旋30 s，經0.22 μm濾膜過濾后上機分析。

1.3.2 標準溶液配制

準確稱取10 mg苯并烯氟菌唑標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 μg/mL標準儲備液，于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1%氨水，流動相B為乙腈，流速0.25 mL/min；進樣量10.0 μL；柱溫40 ℃。梯度洗脫程序：0～0.5 min，5%～50% B；0.5～1.0 min，50%～95% B；1.0～2.0 min，95% B；2.0～2.1 min，95%～5% B；2.1～5 min，5% B。

1.3.4 質譜條件

霧化氣3 mL/min；干燥氣10 mL/min；加熱氣10 mL/min；電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），負離子掃描；監測方式采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源接口溫度300 ℃；脫溶劑溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃。苯并烯氟菌唑質譜參數見表1。

表1 苯并烯氟菌唑質譜參數

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

將1.0 μg/mL苯并烯氟菌唑標準溶液以流動注射的方式進樣。噻霉酮在ESI源負離子模式下信號豐度遠高于正離子模式下，產生帶負電荷的分子離子峰[M-H]-，因此選擇負離子掃描模式。通過優化錐孔電壓和碰撞能量，選擇離子豐度最高、基體干擾較小的離子對作為特征離子對，選擇豐度最強的碎片離子作為定量離子。進一步優化毛細管電壓等參數，使其離子化效率達到最佳，苯并烯氟菌唑的質譜參數見表1。

2.2 色譜柱的選擇

在相同色譜條件下，考察Waters HSS T3、Waters BEH C18、Zobax Eclipse Plus C18、Waters XSelectR CSHTMC18對苯并烯氟菌唑的分離效果。結果發現，采用Waters BEH C18色譜柱可有效分離苯并烯氟菌唑，峰形尖銳、對稱，而且在4 min內就可完成對樣品的分析，分析速度顯著提高，見圖1。因此選擇Waters BEH C18柱作為分析柱。

圖1 苯并烯氟菌唑的提取離子總離子流圖

2.3 流動相的選擇

分別以甲醇、乙腈作為有機相，0.1%氨水、含5 mmol/mL乙酸銨、純水作為水相，進行組合條件的考察。結果發現：水相采用0.1%氨水比純水、含5 mmol/mL乙酸銨可有效提高苯并烯氟菌唑的離子化效率，增強響應信號，且有較好的峰形；以乙腈作為有機相時，與甲醇相比，可在短時間內將目標物分離出來，且出峰狀況更佳；以乙腈-0.1%氨水作為流動相時，苯并烯氟菌唑的分離效果、質譜信號響應強度最佳（圖1）。因此，選擇乙腈-0.1%氨水作為流動相。

2.4 凈化劑的選擇

果蔬中含有大量色素、有機酸、纖維素、維生素與糖類。QuEChERS方法使用較多的凈化劑材料有PSA、C18、GCB。PSA起到弱陰離子交換的作用，去除脂肪酸、糖、有機酸效果較好，C18吸附劑主要除去脂類及多環芳烴等非極性、弱極性和中等極性化合物，GCB吸附色素和非極性、弱極性化合物[13]。試驗采用C18/PSA/MgSO4、GCB/PSA/MgSO4、PSA/MgSO4、C18/PSA、C18/MgSO4這5種組合比較凈化效果。結果發現，GCB會吸附苯并烯氟菌唑，GCB/PSA/MgSO4回收率為29%，回收最低；C18/PSA/MgSO4、PSA/MgSO4和C18/MgSO4組合回收率介于52%～60%；C18/PSA組合凈化后的提取液最澄清，凈化效果最好，回收率最高。綜合不同類型吸附劑組合的凈化效果和加標回收率，最終選擇C18/PSA作為凈化吸附劑。

2.5 基質效應

分別以20%乙腈-水溶液，黃瓜、番茄、冬瓜、蘋果和梨空白樣品溶液（空白樣品按照1.3.1處理所得）作為溶劑配制苯并烯氟菌唑的標準溶液和基質溶液，比較兩者的平均響應值，用以判斷基質效應（matrix effect，ME）的影響，計算如式（1）所示[14]。

從表2可以看出，不同樣品基質的ME在71.3%～76.8%直徑，不能忽略。因此，試驗采用基質標樣外標法定量以確保結果的準確性。

表2 苯并烯氟菌唑的基質效應、線性范圍、檢出限與定量限

2.6 線性范圍、檢出限和定量限

將質量濃度0.5，1.0，5.0，10.0，50.0和100.0 ng/mL的標準工作溶液，按上述分析條件進行測定，外標法定量。以濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），制作標準曲線。

從表2可以看出，苯并烯氟菌唑在0.5～100.0 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.99。對不同基質空白提取液進行加標測定，確定苯并烯氟菌唑在黃瓜、番茄、冬瓜、蘋果和梨中的方法檢出限均為1 μg/kg，定量限均為2 μg/kg。

2.7 準確度和精密度

在空白果蔬樣品中分別添加0.5，5.0和50.0 μg/kg這3個濃度水平，按1.3.1對樣品進行前處理，每個濃度水平平行6次試驗。從表3可以看出，平均加標回收率是74.3%～90.8%，相對標準偏差SRSD是1.8%～4.1%，表明該方法具有較好的重現性與準確性。

表3 不同基質中苯并烯氟菌唑的回收率和精密度（n=6）

2.8 實際樣品分析

隨機抽取45批市售的黃瓜、番茄、冬瓜、蘋果和梨，應用試驗方法對樣品進行苯并烯氟菌唑殘留檢測。結果表明，樣品中均未檢出苯并烯氟菌唑。

3 結論

采用QuEChERS樣品前處理方法，建立液相色譜-串聯質譜法測定果蔬中苯并烯氟菌唑殘留的方法。該方法具有操作簡單、定性定量準確、靈敏度高的優點，滿足快速檢測果蔬中苯并烯氟菌唑殘留的分析要求。