益生元對抗幽門螺旋桿菌益生菌的作用

常馨佳，梁馨文，劉建偉，邵明亮

西安諾眾康健生物科技有限責任公司（西安 710000）

幽門螺桿菌是感染者胃微生物群的主要組成部分，是慢性胃炎、消化性潰瘍病和癌癥的致病因素之一。目前幽門螺旋桿菌根除方案主要以鉍劑四聯療法為主，但隨著抗生素耐藥性的增加，國內外眾多學者不斷探索兼具有效根除率和副作用可控的新療法[1]。益生菌作為一種佐劑在臨床應用中可提高幽門螺旋桿菌根除率和（或）減少根除過程中的不良反應，在免疫與非免疫方面都呈現出相應的作用[2]。目前臨床上常用的益生菌包括乳酸菌、雙歧桿菌等[3]。其中有研究和發明專利表明約氏乳桿菌MH-68[4]、植物乳桿菌CN 2018[5]、副干酪乳桿菌JLPF-176[6]、乳雙歧桿菌Probio-M 8[7]、嗜酸乳桿菌LA-10 A[8]可以抑制幽門螺旋桿菌。

但益生菌存在定殖率低、活菌存活率低、產品貨架期短等問題，而益生元作為能夠促進益生菌在宿主體內生長或繁殖的一種有益成分，具有穩定性好、貨架期長的優勢，能很好地解決以上缺點[9]。益生元是不能被宿主消化，但可以被益生菌利用和發酵的化合物，從而促進腸道益生菌的繁殖和代謝，促進身體健康[10]。益生元通常是指一些多糖、低聚糖、微藻類、天然植物等，來源比較廣泛[11]。目前市面上的食品中最常添加的益生元有低聚甘露糖、菊粉、低聚木糖、水蘇糖、低聚半乳糖、抗性糊精、低聚異麥芽糖、低聚果糖等。但不同益生菌對不同益生元具有選擇偏好性，且具有菌株特異性[12-15]。針對不同益生元對不同益生菌的增殖效果存在差異這一現象，此研究選擇低聚甘露糖、菊粉、低聚木糖、水蘇糖、低聚半乳糖、抗性糊精、低聚異麥芽糖、低聚果糖共8種益生元與約氏乳桿菌MH-68、植物乳桿菌CN 2018、副干酪乳桿菌JLPF-176、乳雙歧桿菌Probio-M 8、嗜酸乳桿菌LA-10 A共5種能夠抗幽門螺旋桿菌的益生菌進行體外試驗，分析不同益生元及其對應單糖對益生菌的增殖情況，以期確定增殖效果最優的益生元組合，為益生元協同益生菌抗幽門螺旋桿菌的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

1.1.1 材料

低聚甘露糖（85%，西安諾眾康健生物科技有限責任公司）；菊粉（90%，重慶驕王天然產物股份有限公司）；低聚木糖（95%，山東龍力生物科技股份有限公司）；水蘇糖（80%，西安天美生物科技股份有限公司）；低聚半乳糖（90%，山東百龍創園生物科技有限公司）；抗性糊精（保齡寶生物股份有限公司）；低聚異麥芽糖（90%，山東百龍創園生物科技有限公司）；低聚果糖（95%，保齡寶生物股份有限公司）；D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖（北京索萊寶生物科技有限公司）。

約氏乳桿菌MH-68（中國典型培養物保藏中心，CCTCC NO：M 2011128，錦喬生物科技有限公司）；植物乳桿菌CN 2018（中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC No.4286，河北一然生物科技股份有限公司）；副干酪乳桿菌JLPF-176（中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC No.18043，山東中科嘉億生物工程有限公司）；乳雙歧桿菌（Probio-M 8，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC No.18610，北京科拓恒通生物技術股份有限公司）；嗜酸乳桿菌LA-10 A[中國典型培養物保藏中心，CCTCC NO：M 2019012，善恩康生物科技（蘇州）有限公司]。

1.1.2 試劑與儀器

酪蛋白胨、牛肉粉、酵母粉（北京奧博星生物技術有限責任公司）；葡萄糖、硫酸鎂、檸檬酸三銨（天津市天力化學試劑有限公司）；硫酸錳、磷酸氫二鉀、乙酸鈉（西隴科學股份有限公司）；吐溫80（阿拉丁試劑上海有限公司）。

SW-CJ-2 FD超凈工作臺（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；LDZF-50 L高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；LAI-3厭氧培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司）；Alpha 1502紫外分光光度儀（上海譜元儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制方法

MRS培養基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1.0 L，pH 6.2±0.2。其中每1.0 LMRS培養基中加入20 g瓊脂粉，即可配制成MRS固體培養基。

缺碳培養基：MRS基礎培養基中去除葡萄糖即可制備為缺碳培養基。

益生元培養基：先將益生元配制為10%益生元溶液，再以20%的比例將10%益生元溶液加入缺碳培養基中，即可制備為益生元培養基。

1.2.2 試驗菌培養方法

菌種活化：將益生菌干粉用涂布器均勻涂布于培養皿上，于指定培養條件下培養。挑取培養皿上的單菌落接種至裝有MRS液體培養基的試管中，于37 ℃恒溫厭氧培養。

生長曲線繪制：將活化好的菌株按2%的接種量接種至MRS液體培養基中，在37 ℃下培養24 h。分別于2，4，6，8，10，12，14，16，18和24 h測定1次菌液的吸光度（A600），以時間為橫坐標，A600為縱坐標建立菌株的生長曲線。

1.2.3 接種試驗

將培養至穩定期的菌液以2%的接種量分別接種至基礎培養基、缺碳培養基和益生元培養基中，于厭氧培養箱中37 ℃恒溫靜置培養24 h，在穩定期測定OD600值。

1.2.4 數據處理

此試驗使用SPSS 22.0分析軟件進行顯著性差異檢驗，不同小寫字母表示各個處理之間有顯著性差異（P＜0.05）。使用Origin 2022作圖。每個處理測定3個重復。

2 結果與分析

2.1 不同乳桿菌的生長曲線

在對細菌進行各種特性的比較研究時，一般選擇對數生長末期、穩定期初始階段的細菌[16]。此試驗對不同乳桿菌生長曲線進行了繪制。由圖1（A）可以看出約氏乳桿菌MH-68在2～10 h為對數生長期，10 h后進入生長穩定期。由圖1（B）可知，植物乳桿菌CN 2018在2～12 h為對數期，12 h以后進入穩定期。由圖1（C）和（D）可知，副干酪乳桿菌JLPF-176和乳雙歧桿菌Probio-M 8在16 h以后進入穩定期。由圖1（E）可知，嗜酸乳桿菌LA-10A在2～14 h進入對數生長期，14 h后進入穩定期。因此，針對不同乳桿菌分別選擇它們的穩定期初始階段作為發酵終點進行后續試驗。

圖1 不同乳桿菌的生長曲線

2.2 不同益生元對抗幽門螺旋桿菌益生菌增殖試驗

試驗通過測定菌液在波長600 nm處的吸光度來評價8種益生元對5種抗幽門螺旋桿菌的益生菌的增殖能力，結果如圖2所示。

圖2 益生元對抗幽門螺旋桿菌益生菌的增殖作用

（1）低聚木糖、抗性糊精和菊粉對5種益生菌增殖效果均較差，菌液吸光度均小于1.5。

（2）低聚甘露糖對5種抗幽門螺旋桿菌的益生菌均有較好的增殖效果，菌液吸光度均大于1.5。其中，低聚甘露糖對約氏乳桿菌MH-68和嗜酸乳桿菌LA-10 A的增殖效果均顯著高于其他益生元（P＜0.05）。

（3）低聚異麥芽糖和低聚果糖對植物乳桿菌CN 2018、副干酪乳桿菌JLPF-176和乳雙歧桿菌Probio-M 8增殖效果較強，與其他益生元相比有顯著性差異（P＜0.05）。

從上述試驗結果可以看出，低聚甘露糖、低聚果糖和低聚異麥芽糖對5種抗幽門螺旋桿菌的益生菌增殖有較強的效果，且不同益生菌對不同益生元的利用度存在差異。其中菊粉的增殖效果顯著低于低聚果糖（P＜0.05），菊粉和低聚果糖均是果糖聚合物，菊粉聚合度在2～60之間，低聚果糖聚合度在2～10之間[17]。由此可見，菊粉對5種抗幽益生菌的增殖效果差的可能原因是聚合度較高，其高聚合度結構使益生菌較難分解利用，且低聚合度的低聚果糖的水溶性高于高聚合度的菊粉，有利于益生菌的快速利用[10,18]。可見益生元聚合度大小是影響抗幽門螺旋桿菌益生菌增殖效果的原因之一。

2.3 單糖對抗幽門螺旋桿菌益生菌的增殖試驗

為探究不同益生元對菌株增殖效果存在顯著性差異的其他原因，試驗選用不同益生元所對應的單糖增殖抗幽門螺旋桿菌的益生菌，結果如圖3和圖4所示。

圖4 益生元及對應單糖對抗幽門螺旋桿菌益生菌的增殖作用

（1）D-木糖對5種益生菌的增殖效果較差，與其他益生元相比均有顯著性差異（P＜0.05）。由圖4可以看出，這與低聚木糖的試驗結果相吻合。說明低聚木糖對抗幽門菌株的增殖作用顯著低于其他益生元主要是由于D-木糖構型引起的，這5種抗幽門螺旋桿菌益生菌對D-木糖的利用度低。

（2）D-甘露糖對5種益生菌增殖效果較好，菌液吸光度均大于1.5。D-甘露糖對嗜酸乳桿菌LA-10 A的增殖效果均顯著高于其他單糖（P＜0.05）。與上一試驗結果吻合，說明低聚甘露糖對于嗜酸乳桿菌LA-10 A的增殖優勢主要是由于D-甘露糖構型所決定的。

（3）由圖4可以看出，D-半乳糖和低聚半乳糖對約氏乳桿菌MH-68的增殖效果存在較大差異。D-半乳糖對約氏乳桿菌MH-68的增殖效果較好，與D-甘露糖相比沒有顯著性差異。在上一試驗結果中，低聚半乳糖增殖效果顯著低于低聚甘露糖和低聚果糖（P＜0.05）。這一現象說明，約氏乳桿菌MH-68對低聚半乳糖的利用度低與其單糖構型關系較小，更主要的原因可能是與低聚半乳糖所含的糖苷鍵有關。

（4）由圖4可以看出，D-果糖和低聚果糖對約氏乳桿菌MH-68的增殖效果存在較大差異。D-果糖對植物乳桿菌CN 2018的增殖效果顯著低于D-甘露糖和D-半乳糖（P＜0.05）。而在上一試驗結果中，低聚果糖對植物乳桿菌CN 2018的增殖效果顯著高于低聚甘露糖和低聚半乳糖（P＜0.05）。這一現象說明，低聚果糖對植物乳桿菌CN 2018的增殖效果可能與低聚果糖中含有的糖苷鍵有關，與其單糖構型關系較小。

上述試驗結果說明，抗幽門螺旋桿菌的益生菌對益生元的利用度高低的一部分原因是由益生元單糖構型所決定的，另外，除了單糖的不同，益生元所含的糖苷鍵對增殖效果也有一定影響。

2.4 益生元組合對抗幽門螺旋桿菌益生菌的增殖試驗

根據上述試驗結果，選用對抗幽門螺旋桿菌益生菌增殖效果較好的低聚異麥芽糖、低聚甘露糖和低聚果糖進行復配，旨在篩選出對抗幽門螺旋桿菌益生菌增殖效果最好的益生元組合。

由圖5可以看出：對于約氏乳桿菌MH-68、植物乳桿菌CN 2018和嗜酸乳桿菌LA-10 A來說，MOS/FOS 3∶1和MOS/FOS 2∶2時增殖效果較好。對于副干酪乳桿菌JLPF-176來說，MOS/FOS 1∶3和MOS/FOS 3∶1時增殖效果較好。對于乳雙歧桿菌Probio-M 8來說，IMO/MOS 3∶1和MOS/FOS 1∶3增殖效果較好。

圖5 益生元組合對抗幽門螺旋桿菌益生菌的增殖作用

研究得出：低聚甘露糖和低聚果糖進行復配是較好的結果。

由表1可以看出，MOS/FOS 3∶1、MOS/FOS 2∶2與MOS/FOS 1∶3三種組合對于乳雙歧桿菌Probio-M 8和嗜酸乳桿菌LA-10 A的增殖效果均無顯著性差異（P＜0.05），但對于約氏乳桿菌MH-68和植物乳桿菌CN 2018，MOS/FOS 1∶3的增殖效果顯著低于其他兩種組合（P＜0.05）。對于植物乳桿菌CN 2018，MOS/FOS 2∶2的增殖效果顯著低于MOS/FOS 3∶1（P＜0.05）。可得出MOS/FOS 3∶1為增殖抗幽門螺旋桿菌益生菌的最佳組合。

表1 益生元組合對抗幽門螺旋桿菌益生菌的增殖作用

3 結論

通過試驗的分析可以得出：低聚甘露糖、低聚果糖和低聚異麥芽糖對5種抗幽門螺旋桿菌益生菌（約氏乳桿菌MH-68、植物乳桿菌CN 2018、副干酪乳桿菌JLPF-176、乳雙歧桿菌Probio-M 8、嗜酸乳桿菌LA-10 A）的增殖效果優于菊粉、低聚木糖、水蘇糖、低聚半乳糖和抗性糊精。試驗進一步將增殖效果較好的低聚果糖、低聚甘露糖和低聚異麥芽糖進行復配。當低聚甘露糖與低聚果糖比例為3∶1時對抗幽門螺旋桿菌益生菌增殖效果最好，可作為最佳的復合益生元組合。為益生元協同益生菌清除幽門螺旋桿菌提供了一定的理論參考依據。其中不同益生元對菌株增殖效果存在差異的主要原因可能是益生元聚合度的大小、其對應單糖增殖菌株效果及其含有的糖苷鍵類型的不同，具體的作用機制有待下一步深入研究。