黑豆不同發芽期多酚、黃酮及抗氧化活性分析

李楠，孟航婷，孫元琳，王芮東

1. 運城學院生命科學系（運城 044000）；2. 運城學院理科實驗中心（運城 044000）

黑豆（Glycine maxVar）是豆科植物的黑色種子，含有大量的營養物質和生物活性物質，如蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素、微量元素、酚類物質、異黃酮、花青素等，可以降低血脂，促進膽固醇的代謝，具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤等作用[1-2]。但黑豆中也含有蛋白酶抑制劑、植酸、脂肪氧化酶等抗營養成分，影響黑豆在體內的生物利用度，因此，如何消除這些抗營養成分，并最大限度保留黑豆中原有的營養素，成為亟待解決的問題。有研究表明，發芽能夠激活種子的內源酶和代謝通路，豆類等經過發芽后，其化學組分會發生改變，抗營養因子減少，某些活性成分增加，食品的感官性能和風味得以改善，實用價值及保健功能提高[3-5]。Okumura等[6]的研究發現蠶豆芽中的酚類化合物為山奈酚，蠶豆發芽后其抗氧化性高于未發芽蠶豆和其他豆類。羅旭等[7]通過相關性分析發現，大豆萌芽過程中活性物質增加，特別是總多酚和總黃酮含量越高，其抗氧化能力越強。杜高發等[8]發現鷹嘴豆在發芽過程中蛋白質含量下降而氨基酸含量升高，不溶性膳食纖維含量下降而可溶性膳食纖維含量升高。鮑會梅[9]發現黑豆發芽過程中葉綠素、維生素C、異黃酮、多酚等成分增加，發芽5～6 d營養價值最高。所以，豆類發芽并開發芽苗菜產品受到密切關注。

黑豆在水培發芽過程中，多酚、黃酮等活性物質含量及抗氧化活性如何變化尚不清楚，因此以黑豆為原料，于25 ℃水培發芽，每隔12 h采樣，測定黑豆不同發芽期多酚、黃酮、花青素含量的變化和對DPPH·、ABTS+·和·OH的清除能力，并分析活性物質與抗氧化活性之間的相關性，以期為黑豆資源的多元化利用、黑豆芽苗菜的選育及黑豆芽苗菜功能性產品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆（產自山東省濟寧市）。沒食子酸、福林酚、蘆丁、DPPH、ABTS（合肥博美生物科技有限公司）；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、過硫酸鉀、水楊酸、硫酸亞鐵、30%過氧化氫等（均為市售，分析純）。

1.2 主要儀器與設備

UV 5500PC紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；SPX-100B-Z生化培養箱（上海博迅實業有限公司）；FA1604電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；LK-800A搖擺式中藥粉碎機（上海隆拓儀器設備有限公司）；TDL6M離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）；KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-3C數顯酸度計（杭州奧立龍儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑豆發芽條件

選取顆粒飽滿的黑豆，用蒸餾水沖洗以去除表面灰塵，用蒸餾水浸泡8 h，將黑豆單層均勻平鋪于發芽器網格盤中，底盤中加入適量蒸餾水，于25 ℃生化培養箱中發芽，每6～8 h噴1次水，每隔12 h收集發芽的黑豆[10]。

1.3.2 樣品前處理

將收集的樣品置于50 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干，直至恒重，用中藥粉碎機粉碎，過0.180 mm孔徑（80目）篩。將樣品粉末用沸程30～60 ℃的石油醚浸泡12 h，以除去其中的油脂，脫脂后的樣品粉末置于通風處，揮干溶劑，置于密封袋中，-20 ℃冰箱保存備用[11]。

稱取1 g脫脂樣品粉末，加入30 mL 70%乙醇，避光超聲提取30 min，提取溫度70 ℃，功率300 W，在3 000 r/min下離心15 min，收集上清液，重復提取2次，合并上清液并定容至100 mL得樣品提取液[12]。

1.3.3 活性物質測定方法

1.3.3.1 多酚含量測定

參考王飛霞等[13]的方法并稍做修改。準確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL的0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液，加入1 mL福林酚試劑，反應5 min，加入2 mL 15%的NaCO3，用蒸餾水定容至10 mL，避光反應60 min，于765 nm波長處測定其吸光度。得標準曲線y=0.916 9x+0.117 8，R2=0.971 1，其中x為沒食子酸質量濃度（mg/mL），y為吸光度。準確吸取1 mL樣品提取液，按照上述方法測定其吸光度，并將結果換算成多酚含量。

1.3.3.2 黃酮含量測定

參考南海娟等[14]的方法并稍作修改。準確吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0和2.4 mL的0.2 mg/mL蘆丁標準溶液，加0.2 mL 5% NaNO2；6 min后，加0.2 mL 10% Al(NO3)3；6 min后，加入2 mL 4% NaOH，用60%乙醇定容至10 mL，混勻，避光反應15 min，在波長510 nm處測定吸光度。得標準曲線y=0.086 8x-0.002 1，R2=0.996 3，其中x為蘆丁質量濃度（mg/mL），y為吸光度。準確吸取1 mL樣品提取液，按照上述方法測定其吸光度，并將結果換算成黃酮含量。

1.3.3.3 花青素含量測定

參考汪洋等[15]的方法并稍作修改。準確稱取1 g脫脂樣品粉末，加入1%鹽酸-乙醇混合液40 mL，于55℃水浴浸提120 min。冷卻至室溫后過濾，得樣品溶液。采用消光系數法測定花青素含量。在波長525 nm下測定樣品的吸光度，按照式（1）計算花青素含量（mg/g）。

式中：A為樣品吸光度；V為定容體積，mL；M為樣品質量，g；98.2為花色苷平均消光系數。

1.3.4 抗氧化活性測定方法

1.3.4.1 對DPPH·清除率的測定

參考趙巧玲等[16]的方法并稍作修改。取2.0 mL樣品提取液，加入4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，用蒸餾水定容至10 mL，避光反應30 min，在波長517 nm處測定樣品組吸光度。根據式（2）求DPPH·清除率。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為樣品本底吸光度；A0為以蒸餾水代替樣品提取液的空白對照吸光度。

1.3.4.2 對ABTS+·清除率的測定

參考胡治遠等[17]的方法并取樣品提取液0.1 mL測定對ABTS+·清除率，根據式（2）計算對ABTS+·清除率。

1.3.4.3 對·OH清除率的測定

參考蔡萌等[18]的方法，根據式（2）求對·OH清除率。

2 結果與分析

2.1 多酚含量變化

由圖1可知，多酚含量在前48 h變化不顯著（P＜0.05），后呈平穩上升趨勢，發芽至84 h時，多酚含量達到最大值，為8.3 mg/g，與發芽72 h和96 h差異顯著（P＜0.05）。推測是因為黑豆發芽后，會激活苯丙烷代謝途徑，相關酶活力增加，降解細胞壁周圍的成分，因而酚類物質與蛋白質、多糖之間的共價鍵被破壞，結合酚被釋放從而游離出來，使總酚含量呈上升趨勢[19]。另外，多酚含量變化趨勢與多酚氧化酶的含量及活性相關，發芽初期，多酚氧化酶活性較高，會氧化分解一部分多酚化合物，因而發芽前48 h多酚含量變化不顯著，隨著發芽時間延長，多酚氧化酶的活力逐漸下降，多酚含量也隨之增加[20]。結果表明黑豆發芽后，多酚含量會顯著增加。

圖1 黑豆不同發芽期多酚含量的變化

2.2 黃酮含量變化

由圖2可知，隨著發芽時間的延長，黃酮含量呈上升趨勢，從發芽12 h到發芽96 h，其含量增加3.9 mg/g，表明黑豆在發芽過程中進行黃酮的合成。有研究表明，苯丙氨酸氨解酶是黃酮類次生代謝產物形成的關鍵酶，在種子發芽初期，酶活力較低，隨著發芽時間的延長，呼吸作用增強，酶的種類和數量增加，酶活性不斷提高[9]，所以黑豆發芽過程中黃酮含量不斷上升。

圖2 黑豆不同發芽期黃酮含量的變化

2.3 花青素含量變化

由圖3可知，花青素含量在黑豆發芽過程中不斷下降。黑豆在發芽12 h時，其花青素含量最高，為3.635 mg/g，發芽96 h時其含量最低，為0.267 mg/g，下降值為3.369 mg/g。不同發芽時間花青素含量存在顯著性差異（P＜0.05）。趙巧玲等[16]研究結果表明，在武鄉小黑豆發芽過程中，其種皮花色苷含量逐漸降低，與試驗結果相似。黑豆中花青素主要集中在黑豆表皮，是一種水溶性植物色素，浸泡黑豆時，花青素溶解在水中，含量降低，發芽過程中淋水也會造成花青素含量的損失[21]。所以隨發芽時間延長，花青素含量降低。

圖3 黑豆不同發芽期花青素含量的變化

2.4 抗氧化活性變化

由圖4（A）可知，黑豆發芽過程中，對DPPH·清除率先略微下降后呈一直上升趨勢，發芽24 h時對DPPH·清除率最弱，隨著發芽時間的延長，在84 h時達到最大值，為57.18%。由圖4（B）可知，其對ABTS+·清除率呈上升趨勢，在96 h時達到最大值，為54.78%。由圖4（C）可知，其對·OH的清除率呈現先增加后下降趨勢，在72 h時清除率最大，為26.13%。

圖4 黑豆不同發芽期對不同自由基清除率的變化

多酚與黃酮類化合物是植物的主要次生代謝產物，種子萌芽會激發種子內大量酶的活性，使多酚與黃酮等次級代謝產物大量生成，而多酚和黃酮是天然的抗氧化劑，具有較強的抗氧化及清除自由基的能力，所以，在黑豆發芽過程中，隨著發芽時間延長，對DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率逐漸升高。李麗等[22]研究表明，赤小豆在發芽過程中抗氧化能力明顯提升，在第5天達到最高，并得出發揮抗氧化作用的主要成分為4種酚酸和7種黃酮類物質。呂俊麗等[19]在研究發芽對莜麥體外抗氧化能力的影響時，得出隨著發芽時間延長，莜麥總還原能力、對DPPH·和羥基自由基的清除能力增強的結論，與試驗結果相似。

2.5 相關性分析

用SPSS軟件對不同發芽時間黑豆多酚、黃酮、花青素含量與其對DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率做相關性分析，結果見表1。

表1 多酚、黃酮、花青素含量與抗氧化能力的相關系數

不同發芽時間黑豆多酚、黃酮含量與其對DPPH·、ABTS+·和·OH清除率均呈一定正相關性（P＜0.05），多酚含量和3種自由基清除率相關系數分別為0.950，0.767和0.778，黃酮含量和3種自由基清除率相關系數分別為0.830，0.959和0.761，表明多酚、黃酮含量均和3種自由基清除率顯著正相關。花青素含量與上述自由基清除率呈負相關。馬燕等[23]在研究發芽對小麥抗氧化能力的影響時證實，不同生長階段的小麥總酚含量與自由基清除率呈現顯著正相關，與試驗結果相同。趙齊燕等[24]的研究發現紫云英苗菜的總酚、總黃酮含量與DPPH·、ABTS+·清除能力顯著相關，且貢獻率較大的活性物質為山奈酚、槲皮素和阿魏酸。趙天瑤等[25]發現豆類種子中酚類物質含量與抗氧化性存在正相關關系，在黑豆發芽過程中，會積累多酚及黃酮類物質，其清除自由基能力增加，所以，黑豆發芽后，營養價值及保健功能得以提升。

3 結論

探究黑豆水培發芽過程中多酚、黃酮等活性物質和抗氧化活性的變化，結果表明黑豆發芽過程中多酚、黃酮含量呈不斷上升趨勢，花青素呈下降趨勢，相對于萌芽初期，多酚及黃酮含量增加顯著（P＜0.05）。黑豆發芽過程中對DPPH·清除率先略微下降后一直上升，對ABTS+·清除率一直增加，對·OH清除率呈現先增加后下降趨勢。相關性分析表明，不同發芽期多酚、黃酮含量與其對DPPH·、ABTS+·和·OH清除率均呈一定正相關性（P＜0.05）。試驗結果為黑豆的綜合利用和進一步開發黑豆芽苗菜功能性食品提供數據支撐。