粒徑對蛹蟲草活性物質(zhì)溶出量的影響

李曉倩，郇靖宇，智婷，楊航，李鎵汕，郭紹芬

臨沂大學(xué)醫(yī)學(xué)院（臨沂 276005）

蛹蟲草又稱北冬蟲夏草，是一種昆蟲病原真菌，隸屬于天冬科和子囊菌，是一種有價值的藥用和食用絲狀真菌，在東亞被廣泛用作營養(yǎng)食品和中藥材[1-5]。野生蛹蟲草就是子囊菌寄生在鱗翅目等昆蟲蛹體中[6]，蛹體充滿菌絲變成僵蛹后，自蛹體的頭、胸、腹等長出帶子囊殼的子座，其顏色呈橙黃色或近橙紅色，價格昂貴且稀有。為了馴化蛹蟲草，有研究利用子囊菌接種于桑蠶、家蠶等成功獲得蛹蟲草子實體（即人工培養(yǎng)）[7]。有研究表明，利用大米、麥粒等培養(yǎng)基來模擬蠶蛹的營養(yǎng)環(huán)境，成功獲得蛹蟲草子實體（即固體培養(yǎng)基培養(yǎng)）[8]，這種子實體又名為蟲草花。固體培養(yǎng)殘基可通過酵母菌生成可食用乙醇[9]。近年來，蛹蟲草的液體發(fā)酵培養(yǎng)成為蛹蟲草培養(yǎng)的一種新模式，蛹蟲草液體培養(yǎng)就是將子囊菌生長發(fā)育過程中需要的營養(yǎng)物質(zhì)混合于水溶液中，通過人為控制外界條件，從而培養(yǎng)出大量菌絲體[10]。

蛹蟲草既可作為一種藥材治療疾病，同時又是具有滋補(bǔ)作用的營養(yǎng)物質(zhì)，是一種藥食兩用的真菌。蛹蟲草中含有腺苷、蛋白質(zhì)、噴司他丁、N6-2-羥乙基腺苷等重要有效成分，具有擁有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗病毒、抑菌的活性，具有廣闊的前景[11]。經(jīng)過研究表明，蛹蟲草中富含蟲草酸、核苷類成分和甾醇類等多種藥效成分，并具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗炎抑菌、抗腫瘤等多種藥理作用，其藥用價值和食用價值都很高。對蛹蟲草的研究大多是關(guān)于其蟲草素和多糖等有效成分的提取純化及有效成分藥理作用，或探究蛹蟲草植物體本身的生長和培育條件等，而有關(guān)不同粒徑對蛹蟲草活性物質(zhì)的提取和溶出量影響研究尚不多見。試驗采用高效液相色譜儀和紫外分光光度計測定蛹蟲草的活性物質(zhì)含量，并分析出最佳的粒徑。研究粒徑對有效成分的溶出的影響，可為蛹蟲草的實際應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草為善一坊地道藥材、噴司他丁標(biāo)準(zhǔn)品、麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、N6-2-羥乙基腺苷標(biāo)準(zhǔn)品、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（成都埃法生物科技有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（成都普思生物科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速離心機(jī)（TDL-80-2B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；紫外可見分光光度計（T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高效液相色譜儀（Agilent1200，美國安捷倫有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取購得的蛹蟲草子實體干樣于50 ℃烘箱烘干1 h，放入粉碎機(jī)中粉碎30 s，粉碎的蛹蟲草粉末過藥典篩，取過1號篩而未能過2號篩的為1號樣品（粒徑為1.7 mm），依次類推。樣品編號和粒度關(guān)系如表1所示。

表1 樣品編號和粒度關(guān)系

1.3.2 噴司他丁含量測定

噴司他丁的測定采用張春楊等[12]的方法，并稍做修改。準(zhǔn)確稱取0.05 g樣品于15 mL離心管中，添加10 mL溶劑（V水∶V甲醇∶V乙腈=90∶5∶5），混勻，室溫下，于142 W超聲波清洗器中超聲提取10 min，稱其質(zhì)量，補(bǔ)足質(zhì)量，按3 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜，備用。

通過高效液相色譜法測定噴司他丁含量。高效液相色譜儀安裝Venusil MP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，柱溫25 ℃），流動相為2.5 g/L乙酸銨、甲醇、乙腈，等度洗脫，V水∶V甲醇∶V乙腈=90∶5∶5。進(jìn)樣量10 μL，體積流量1 mL/min，檢測波長282 nm。以市售噴司他丁為標(biāo)準(zhǔn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 麥角甾醇含量測定

采用常襯心[13]方法提取游離的麥角甾醇，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取0.1 g烘干的蛹蟲草粉末于離心管內(nèi)，加入4 mL甲醇在黑暗中浸泡3.5 h，室溫下超聲提取30 min后，將其放到離心機(jī)內(nèi)按3 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，備用。

高效液相色譜儀安裝Ultimate C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，柱溫30 ℃），流動相為100%甲醇，等度洗脫，進(jìn)樣量5 μL，流速1 mL/min，檢測波長284 nm。以市售麥角甾醇為標(biāo)準(zhǔn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 類胡蘿卜素含量測定

采用Yang等[14]方法測定類胡蘿卜素含量，并稍做修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品，加入6 mL鹽酸（1 mol/L）浸泡20 min，溫度30 ℃，按3 000 r/min離心10 min，除去上清液，用蒸餾水洗滌殘渣3次，烘干。于殘渣中添加15 mL有機(jī)試劑（V丙酮∶V石油醚=4∶1），于30 ℃水浴提取2 h，按3 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋20倍，通過比色法在445 nm波長處測定吸光度。類胡蘿卜素溶出量（μg/g）按式（1）計算。

式中：A為吸光度；D為稀釋倍數(shù)；V為提取溶液體積，mL；W為子實體粉末質(zhì)量，g；0.16為類胡蘿卜素的消光系數(shù)。

1.3.5 蟲草酸含量測定

采用李雪芹等[15]方法測定蟲草酸含量，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取1 g樣品于錐形瓶中，加入10 mL 20%乙醇溶液，室溫下，于142 W超聲波清洗器中超聲提取20 min，靜置，補(bǔ)足質(zhì)量。按3 000 r/min離心15 min，提取2次，合并上清液并定容至25 mL，備用。

取40 μL上述上清液，并加入20%乙醇稀釋至1 mL于具塞試管中，加入1 mL 0.015 mol/L高碘酸鈉溶液，混勻，室溫下放置10 min，加入0.1%L-鼠李糖溶液，從而除去過多的高碘酸鈉溶液，加入4 mL Nash試劑（乙酰丙酮試劑），混勻后在53 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，使其顯色，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，通過比色法在412 nm波長處測定蟲草酸含量。以市售蟲草酸為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量測定

采用超聲輔助堿提法提取蛋白質(zhì)。準(zhǔn)取稱取0.1 g樣品于離心管中，添加6 mL pH 10 NaOH水溶液，在30 ℃下，于142 W超聲波清洗器中超聲提取30 min，靜置，冷卻，補(bǔ)足質(zhì)量，按3 000 r/min離心5 min，取上清液，備用。取100 μL上述上清液，并加入pH 10 NaOH水溶液稀釋至1 mL于15 mL離心管中，添加5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250顯色，通過比色法在595 nm波長處測定蛋白質(zhì)含量。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 黃酮含量測定

準(zhǔn)確稱取1 g烘干的蛹蟲草粉末于具塞錐形瓶內(nèi)，加入30 mL 85%甲醇溶液，在80 ℃超聲提取10 min后，將溶液混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，放到離心機(jī)內(nèi)，按3 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。

吸取2 mL樣品溶液，置于25 mL容量瓶中，量取1 mL 5%亞硝酸鈉溶液加入容量瓶，混勻，靜置6 min，量取1 mL 10%硝酸鋁溶液加入容量瓶，混勻，靜置6 min，量取10 mL 4%氫氧化鈉溶液加入容量瓶，加入60%甲醇溶液定容至刻度線，混勻，靜置15 min，在510 nm波長處測吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

從表2可以看出，各標(biāo)準(zhǔn)品在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可依據(jù)此線性方程計算不同粒徑下各成分的溶出量。

表2 各標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系

2.2 粒徑對噴司他丁溶出量的影響

噴司他丁是一種嘌呤核苷類似物，可用于治療毛細(xì)胞白血病[16]。根據(jù)已有文獻(xiàn)可知，噴司他丁可被蛹蟲草合成，這一結(jié)論從遺傳基因的角度得到證明[17]。噴司他丁被合成的濃度大小與蛹蟲草的質(zhì)量好壞有關(guān)，并且與蛹蟲草是否有毒也有關(guān)系。9種粒徑蛹蟲草粉末中噴司他丁溶出量如圖1所示。1和2號粒徑下蛹蟲草粉末中噴司他丁溶出量沒有顯著性差異。從3號樣品粉末之后，噴司他丁溶出量逐漸減小，在6號樣品粉末處噴司他丁溶出量降至最低，在6號蛹蟲草粉末后，隨著藥材粉末粒度不斷縮小，蛹蟲草粉末中噴司他丁溶出量不斷升高，在9號粉末下，噴司他丁溶出量達(dá)到最高，為491.534 μg。可能是因為隨著粒徑變小，粉末與溶劑接觸面積增大，而且超聲波破壞藥材粉末的細(xì)胞膜，使膜內(nèi)物質(zhì)較易溶出，促進(jìn)噴司他丁的溶解。溶出量變化較大，猜測與噴司他丁熱穩(wěn)定性差[12]有關(guān)。因此，噴司他丁最佳溶出粒徑為0.074 mm（9號），應(yīng)采用0.106 mm（8號）～0.074 mm（9號），提高噴司他丁溶出量。

圖1 不同粒徑下噴司他丁溶出量

2.3 粒徑對麥角甾醇溶出量的影響

麥角甾醇與蟲草素聯(lián)合給藥具有抗肺癌及肝癌的作用[18]。9種粒徑蛹蟲草粉末中麥角甾醇溶出量如圖2所示。隨著篩分的粒徑越來越小，麥角甾醇溶出量越來越多，在3號樣品粉末處麥角甾醇達(dá)到最高，為1 785.551 μg/g。在3號篩樣品粉末之后，隨著樣品粉末粒徑逐漸減小，提取的麥角甾醇含量逐漸減少。可能是因為隨著粉末粒徑的減小，比表面積增大，溶劑和溶出成分的接觸面積變大，增加麥角甾醇的溶出。但隨著粉末粒徑的減小，粉末對溶劑吸附力增強(qiáng)，而且超聲時細(xì)胞被破壞，細(xì)胞介質(zhì)溶出，增加溶劑的黏性，導(dǎo)致麥角甾醇溶出減少，因此麥角甾醇的最佳溶出粒徑為0.27 mm（3號），應(yīng)采取1.7 mm（1號）～0.27 mm（3號），提高麥角甾醇溶出量。

圖2 不同粒徑下麥角甾醇溶出量

2.4 粒徑對類胡蘿卜素溶出量的影響

9種粒徑蛹蟲草粉末中類胡蘿卜素溶出量如圖3所示。類胡蘿卜素在1號～7號樣品溶出量不斷增加，在7號樣品粉末類胡蘿卜素溶出量最高達(dá)2 982.283 μg/g，在7號～9號樣品溶出量不斷減少。可能是因為隨著粒徑不斷減小，粉末與溶劑的接觸面積增大，促進(jìn)類胡蘿卜素的溶出，但隨著粉末粒徑的減小，比表面積增加迅速，對溶劑吸附力增強(qiáng)，導(dǎo)致類胡蘿卜素溶出量減少。因此，類胡蘿卜素最佳粒徑為0.12 mm（7號），應(yīng)采取0.15 mm（6號）～10.27 mm（8號），提高類胡蘿卜素溶出量。

2.5 粒徑對蟲草酸溶出量的影響

9種粒徑蛹蟲草粉末中蟲草酸溶出量如圖4所示。蟲草酸在1號～7號樣品溶出量不斷增加，在7號樣品粉末蟲草酸達(dá)到最高，達(dá)62.255 mg/g。在7號～9號樣品蟲草酸溶出量隨粒徑的減少而不斷減少。可能是因為隨著粒徑的減小，粉末比表面積增大，可以有助于粉末中的有效成分的溶出和釋放。隨著粉末粒徑的減小，比表面積增加迅速，對溶劑吸附力增強(qiáng)，另外超聲時細(xì)胞打破，細(xì)胞介質(zhì)溶出，增加溶劑的黏性，均導(dǎo)致蟲草酸的溶出量減少。因此，蟲草酸最佳粒徑為0.12 mm（7號），應(yīng)采取0.15 mm（6號）～0.106 mm（8號），提高蟲草酸溶出量。

圖4 不同粒徑下蟲草酸溶出量

2.6 粒徑對蛋白質(zhì)溶出量的影響

蛹蟲草的蛋白質(zhì)具有各種各樣的作用，如免疫調(diào)節(jié)蛋白可以增強(qiáng)多種免疫功能的作用[19]。9種粒徑蛹蟲草粉末中蛋白質(zhì)的溶出量如圖5所示。隨粒徑逐漸減小，蛋白質(zhì)溶出量逐漸增多，在4號粉末處蛋白質(zhì)的溶出量達(dá)到最大，為12 678.201 μg/g。在4號粉末之后，蛋白質(zhì)溶出量隨著粒徑的不斷變小而逐漸降低。可能是因為隨著粉末粒徑的減小，比表面積增大，溶劑和溶出成分的接觸面積變大，增加活性物質(zhì)的溶出，此外，超聲波提取可對蛹蟲草粉末進(jìn)行加熱，有助于粉末中有效成分的溶出和釋放。達(dá)到最大溶出量后，粉末粒徑過小，對蛋白質(zhì)溶出量影響不明顯。因此，蛋白質(zhì)的最佳溶出粒徑為0.23 mm（4號），應(yīng)采取0.27 mm（3號）～0.18 mm（5號），提高蛋白質(zhì)的溶出量。

圖5 不同粒徑下蛋白質(zhì)溶出量

2.7 粒徑對黃酮溶出量的影響

9種粒徑蛹蟲草粉末中黃酮的溶出量如圖6所示。黃酮在1號～6號樣品粉末溶出量不斷增加，在6號樣品粉末黃酮溶出量最高達(dá)到19.845 mg/g，在6號～9號樣品粉末黃酮溶出量隨著粉末粒徑的減小而不斷減少，可能是因為粉末粒徑減少比表面積增大，溶劑和溶出成分的接觸面積變大，增加活性物質(zhì)的溶出，而且超聲波提取可以對蛹蟲草粉末進(jìn)行加熱，促進(jìn)粉末中的有效成分的溶出和釋放。達(dá)到最大溶出量后，隨著粉末變小，表面能增大，易聚集，另外超聲時蛹蟲草細(xì)胞打破，細(xì)胞介質(zhì)溶出，增加溶劑的黏性，均導(dǎo)致黃酮的溶出量減少。因此，黃酮最佳溶出粒徑為0.15 mm（6號），與黃亞軍等[20]研究結(jié)果一致，應(yīng)采用0.18 mm（5號）～0.12 mm（7號）。

圖6 不同粒徑下黃酮的溶出量

3 結(jié)論

粒徑對活性物質(zhì)的溶出具有較大影響。張德斌等[21]研究粒徑對多糖、腺苷、蟲草素、N6-2-羥乙基腺苷的溶出量的影響。試驗增加噴司他丁、麥角甾醇等活性物質(zhì)，測定蛹蟲草活性物質(zhì)提取的最佳粒徑及粒徑對活性物質(zhì)溶出量的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明：粒徑0.074 mm時的噴司他丁溶出量（491.534 μg）顯著高于其他粒徑；0.27 mm藥材粉末的麥角甾醇溶出量高于其他粒徑，達(dá)1 785.551 μg/g，之后隨著粒徑減小，溶出量減少，類胡蘿卜素溶出量在粒徑0.12 mm達(dá)到最高2 982.283 μg/g，蟲草酸溶出量在粒徑0.12 mm達(dá)到最高62.255 mg/g，蛋白質(zhì)溶出量在粒徑0.23 mm高于其他粒徑，達(dá)12 678.201 μg/g，此后溶出量穩(wěn)定，粒徑0.15 mm粉末的黃酮溶出量（19.845 mg/g）高于其他粒徑。不同粒徑下活性物質(zhì)的溶出量各有差別，不同活性物質(zhì)最大溶出量的粒徑大小不同，但粒徑減小能增加活性物質(zhì)的溶出，粒徑過小會導(dǎo)致粉末吸附溶劑，對于活性物質(zhì)的溶出量并不是粉末粒徑越小越高，因此可以選擇最佳粒徑得到某活性物質(zhì)最大溶出量，為蛹蟲草實際加工應(yīng)用提供一定參考。