奶粉中三聚氰胺基質效應的研究及消除

劉超，呂雪梅，景贊

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺是一種三嗪類含氮環有機化合物[1]，被廣泛運用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、建筑等領域。由于對身體有害，在世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單初步整理參考中，三聚氰胺就在2B類致癌物清單中[2-4]。三聚氰胺的檢測方法主要有重量法、電位滴定法、高效液相色譜法、氣質聯用法和液質聯用法[5-7]。由于液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）具有選擇性好、分析效率高、靈敏度高、定性能力強、定量準確等優點[8-9]，成為檢測原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺的主要方法。但液質聯用檢測食品中三聚氰胺時存在顯著的基質效應，必須采取有效的措施減弱或消除基質效應才能得到準確結果[10]。

基質效應是指因目標分析物不穩定或基質中干擾組分讓目標分析物發生改變，如聚合、酯化等，或是干擾組分與目標分析物的保留時間相同，干擾組分弱化目標分析物的離子化[11-13]。

基于此，試驗考察取樣量、凈化方式、溶劑種類、溶劑用量、三聚氰胺不同濃度等可能影響基質效應的因素，并采用同位素內標法[14-17]消除樣品中的基質效應，提高試驗的準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

DGU-20A-API3200高效液相色譜-串聯質者儀（AB SCIEX公司）；ES-E120B II電子天平（天津市德安特傳感技術有限公司）；TS209358氮吹儀（塔爾博伊斯有限公司）；FUP PT18H高速冷凍離心機（青島法特通訊科技有限公司）；SHA-B數顯恒溫水浴振蕩器（唐山力辰科技有限公司）；KQ-1000VDE數控超聲波清洗機（昆山舒美超聲儀器有限公司）；UPA-L超純水機（唐山力辰科技有限公司）；JRY12固相萃取儀（湖南金蓉儀器設備有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL，沃特世科技（上海）有限公司]；Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，天津艾杰爾科技有限公司）；Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）；三氯乙酸（分析純）；三聚氰胺標準品（99.0%，批號：G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內標標準品（Melamine-13 C3 100 μg/mL，壇墨質檢科技股份有限公司）；水為實驗室一級用水。

奶粉樣品：蒙牛成人奶粉、荷蘭乳牛中老年配方奶粉、蒙牛女士高鈣脫脂奶粉、光明全脂奶粉、河套脫脂奶粉、伊利全脂甜奶粉、飛鶴全脂甜奶粉，均為市售，標為1～7。

1.3 樣品處理

采用GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中4.4.1.1提取、4.4.2凈化的方法。

1.4 三聚氰胺標準儲備液

準確稱取10 mg三聚氰胺標準品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5 三聚氰胺標準及內標中間液

三聚氰胺標準中間液：準確移取25 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

三聚氰胺內標中間液：準確移取250 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.6 液相色譜-質譜/質譜法檢測條件

1.6.1 液相條件

色譜柱為強陽離子交換與C18混合填料，混合比例（1∶4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相為乙酸銨溶液-乙腈（1∶1，V/V），用乙酸調至pH 3；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min。

1.6.2 質譜條件

掃描方式ESI+；離子噴霧電壓4 500 V；霧化氣為氮氣，30 psi；干燥氣為氮氣，30 psi；離子化溫度450 ℃。

1.7 基質效應評價方法

運用定量測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應程度，通過式（1）計算二者比值來評價基質效應。

式中：A和B為基質溶液和純溶劑分析物的峰面積。A/B＜80%，對分析物的響應產生抑制作用；A/B＞120%，對分析物的響應產生增強作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質效應。

1.8 統計分析

采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 取樣量對基質效應的影響

各種奶粉分別取0.50和1.00 g（精確至0.01 g）樣品，按照1.3進行樣品處理，處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積）。將A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質效應是否有顯著性影響，結果見表1和圖1。

圖1 取樣量對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表1 取樣量對基質效應的影響

取樣量對奶粉中三聚氰胺基質效應的統計分析結果如表1所示。因全粉P值＜0.05，因此取樣量對奶粉中三聚氰胺基質效應存在顯著性差異，即存在明顯基質效應。由圖1可知，取樣量0.50和1.00 g對奶粉中三聚氰胺的基質效應分別為37.7%～30.6%和21.0%～28.3%。

2.2 溶劑種類對基質效應的影響

各種奶粉分別取4份1.00 g（精確至0.01 g樣品），分別編號①②③④。編號①，每份奶粉都加入10 mL水；編號②，每份奶粉都分別加入6 mL三氯乙酸（1%）和4 mL水；編號③，每份奶粉都分別加入10 mL三氯乙酸（1%）；編號④，每份奶粉都分別加入8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈。所有樣品超聲提取10 min后，按照1.3處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積）。將A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質效應是否有顯著性影響，結果見表2和圖2。

圖2 不同溶劑對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表2 溶劑種類對基質效應的影響

不同溶劑對奶粉中三聚氰胺基質效應的統計分析結果如表2所示。因奶粉P值均＜0.05，因此溶劑種類對分析奶粉中三聚氰胺基質效應存在顯著性差異，即存在明顯基質效應。由圖2可知，提取溶劑種類對分析物的基質效應差異性除三氯乙酸與V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1之間沒有顯著性差異，其余均有差異顯著。進一步計算水、V乙腈∶V水=3∶2、三氯乙酸和V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1對奶粉中三聚氰胺的基質效應，分別為30.7%～39.3%，23.8%～32.4%，14.9%～23.1%及15.9%～24.8%。提取溶劑種類對分析物的基質效應差異性除三氯乙酸與V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1之間沒有顯著性差異，不存在基質效應，其余存在基質效應。

2.3 溶劑用量對基質效應的影響

分別取3份各奶粉樣品1.00 g（精確至0.01 g），每種奶粉的3份樣品分別編號為①②③。編號①，每個樣品分別加入4 mL三氯乙酸（1%）和1 mL乙腈；編號②，每個樣品分別加入8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈；編號③，每個樣品分別加入12 mL三氯乙酸（1%）和3 mL乙腈。按照1.3處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積）。將A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質效應是否有顯著性影響，結果見表3和圖3。

圖3 溶劑用量對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表3 溶劑用量對基質效應的影響

溶劑用量對奶粉中三聚氰胺基質效應的統計分析結果如表3所示。結合圖3可知，溶劑用量對奶粉中三聚氰胺基質效應除10 mL與15 mL無顯著性差異，不存在基質效應。其余均存在基質效應。因此溶劑用量是影響奶粉中三聚氰胺基質效應的主要因素之一。由圖3可得，溶劑用量為5，10和15 mL對奶粉中三聚氰胺的基質效應，分別為22.1%～32.2%，16.5%～25.5%和12.0%～21.5%。

2.4 不同濃度三聚氰胺對基質效應的影響

分別取各種奶粉樣品3份1.00 g（精確至0.01 g），每種奶粉的3份樣品分別編號為①②③。按照1.3處理后制備成空白溶液，分別取10，50和100 μL三聚氰胺標準中間溶液，用①②③號各空白容易定容至1 mL，搖勻。通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積）。將各奶粉峰面積A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同三聚氰胺濃度對基質效應是否有顯著性影響，結果見表4和圖4。

圖4 不同濃度三聚氰胺對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表4 不同濃度三聚氰胺對基質效應的影響

奶粉中不同濃度三聚氰胺對基質效應影響的統計分析結果如表4所示。由表4可知，不同濃度三聚氰胺對基質效應的影響不存在顯著性差異，不存在基質效應。

2.5 凈化方式對基質效應的影響

分別取各種奶粉4份樣品各1.00 g（精確至0.01 g），每種奶粉的4份樣品分別編號為a、b、c和d。按照1.3提取后，編號a的待凈化液不過柱；編號b的待凈化液過WCX固相萃取柱；編號c的待凈化液過Cleanert PCX固相萃取柱；編號d的待凈化液移過Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱。以上溶液分別通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積）。將A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質效應是否有顯著性影響，結果見表5和圖5。

圖5 凈化方式對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表5 凈化方式對基質效應的影響

凈化方式對奶粉中三聚氰胺基質效應的統計分析結果如表5所示。由圖5進一步可知，凈化類型不過柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX對全脂奶粉中三聚氰胺的基質效應，分別為12.5%～21.2%，15.6%～24.9%，15.1%～26.0%和17.3%～27.0%。

2.6 基質效應的消除

標準曲線的制備：分別移取不同體積的三聚氰胺中間液及相同體積的三聚氰胺內標工作液至6個25 mL容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度，得到質量濃度依次為10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺標準工作液，每毫升三聚氰胺標準工作液中含有三聚氰胺內標濃度為20 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標，三聚氰胺峰面積/內表峰面積為縱坐標得標準曲線回歸方程，見表6。

表6 三聚氰胺標準曲線

稱取9份空白樣品至9支50 mL離心管中，加入20 μL內標中間溶液，分別加入25.0，50.0和100.0 μL三聚氰胺標準中間溶液，按照1.3提取后做三水平三平行回收試驗，記錄各樣品三聚氰胺峰面積和內標峰面積，計算加標回收率。

由表7可知，奶粉回收率在101%～106%之間。數據表明，奶粉回收率較好，內標法徹底消除因基質效應而導致的檢測數據不準確，因此內標法能徹底消除三聚氰胺基質效應帶來影響。

表7 奶粉加標回收率（n=3）

3 結論

試驗借助單因素方差分析探討取樣量、溶劑種類、溶劑用量、不同濃度三聚氰胺、凈化方式等因素對奶粉中三聚氰胺基質效應的影響。試驗結果表明除了不同濃度三聚氰胺，其余因素均存在明顯的基質效應。為消除基質效應帶來的檢測偏差，試驗研究內標法對基質效應的消除，取得明顯效果，得到可靠的試驗結果。